Generowanie i różnicowanie pierwotnych neurosfer z nerwowych komórek macierzystych danio pręgowanego

Zacznij od płytki wielodołkowej zawierającej pożywkę wzrostową wzbogaconą w czynniki wzrostu.

Wysiewaj jednokomórkową zawiesinę nerwowych komórek macierzystych danio pręgowanego i inkubuj.

Początkowo komórki macierzyste wykorzystują czynniki wzrostu i namnażają się.

Usuń zanieczyszczenia i dodaj świeżą pożywkę, aby promować ciągłą proliferację komórek i spontaniczną agregację w celu utworzenia swobodnie unoszących się neurosfer pierwotnych.

Następnie przenieś neurosfery do świeżej studzienki zawierającej pożywkę wzrostową.

Inkubuj w tych samych warunkach, aby wywołać postępującą ekspansję neurosfer.

Kilkakrotnie pipetować, aby mechanicznie zdysocjować neurosfery na małe skupiska.

Następnie przenieś je na dobrze pokrytą macierz zewnątrzkomórkową, ułatwiając ich przyleganie.

Zastąp pożywkę wzrostową pożywką różnicującą wolną od czynnika wzrostu, zawierającą insulinę.

Brak czynników wzrostu i obecność insuliny stymulują różnicowanie komórek w komórki glejowe i neurony z projekcjami neuronalnymi.

Aby przygotować się do generowania neurosfery, napełnij każdą studzienkę 24-dołkowej płytki 300 mikrolitrami świeżej pożywki o stanie Z. Następnie dodaj 200 mikrolitrów zawiesiny komórek do ka