Generowanie i różnicowanie pierwotnych neurosfer z nerwowych komórek macierzystych danio pręgowanego

Zacznij od płytki wielodołkowej zawierającej pożywkę wzrostową wzbogaconą w czynniki wzrostu.

Wysiewaj jednokomórkową zawiesinę nerwowych komórek macierzystych danio pręgowanego i inkubuj.

Początkowo komórki macierzyste wykorzystują czynniki wzrostu i namnażają się.

Usuń zanieczyszczenia i dodaj świeżą pożywkę, aby promować ciągłą proliferację komórek i spontaniczną agregację w celu utworzenia swobodnie unoszących się neurosfer pierwotnych.

Następnie przenieś neurosfery do świeżej studzienki zawierającej pożywkę wzrostową.

Inkubuj w tych samych warunkach, aby wywołać postępującą ekspansję neurosfer.

Kilkakrotnie pipetować, aby mechanicznie zdysocjować neurosfery na małe skupiska.

Następnie przenieś je na dobrze pokrytą macierz zewnątrzkomórkową, ułatwiając ich przyleganie.

Zastąp pożywkę wzrostową pożywką różnicującą wolną od czynnika wzrostu, zawierającą insulinę.

Brak czynników wzrostu i obecność insuliny stymulują różnicowanie komórek w komórki glejowe i neurony z projekcjami neuronalnymi.

Aby przygotować się do generowania neurosfery, napełnij każdą studzienkę 24-dołkowej płytki 300 mikrolitrami świeżej pożywki o stanie Z. Następnie dodaj 200 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej studzienki, wysiewając je w gęstości około 500 komórek na mikrolitr. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla.

Po jednym dniu hodowli obejrzyj komórki na 24-dołkowej płytce pod mikroskopem. Na tym etapie spodziewaj się zaobserwowania zawiesin jednokomórkowych. Jeśli zauważysz, że jakiekolwiek zanieczyszczenia zebrały się w środku studzienki, usuń je, odpipetowując około 100 mikrolitrów pożywki i zastąp tę ciecz, dodając 100 mikrolitrów świeżej pożywki o stanie Z. Po usunięciu wszystkich zanieczyszczeń należy przeprowadzić inkubację płytki w warunkach opisanych powyżej.

Po dodatkowym dniu hodowli przenieś 250 mikrolitrów zawiesiny komórek z jednego dołka do nowej, pustej studzienki. Powtórz ten krok dla wszystkich 24 dołków. Następnie dodaj 250 mikrolitrów świeżej pożywki o stanie Z do każdego dołka i homogenizuj zawiesiny, delikatnie pipetując w górę iw dół. Ponownie inkubować płytki w tych samych warunkach i powtórzyć tę procedurę rozprężania po dodatkowym dniu hodowli. Spodziewaj się zaobserwowania postępującego wzrostu rozmiaru neurosfer w trzecim i czwartym dniu tego okresu.

Aby rozpocząć pasażowanie, po czterech dniach usuń 250 mikrolitrów pożywki, ale bez neurosfer, z każdej studzienki. Następnie użyj pipety o pojemności 1 mililitra, aby mechanicznie zdysocjować neurosfery w pozostałej objętości podłoża. Przystąp do łączenia zawiesiny komórkowej z każdej zdysocjowanej studzienki. Następnie policz komórki za pomocą hemocytometru i rozprowadź 250 mikrolitrów supernatantu z hodowli pierwotnej zawierającego 800 komórek na mikrolitr do każdej studzienki nowej 24-dołkowej płytki. Kontynuuj, dodając 250 mikrolitrów pożywki o stanie Z do każdej studzienki, a następnie inkubując płytkę, jak opisano wcześniej.