JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:33 min. • July 8th, 2025
Zacznij od hodowli neurosfer, swobodnie unoszących się skupisk neuroepitelialnych komórek progenitorowych.
Przenieś te neurosfery na arkusz do osadzania.
Usuń nośnik. Dodaj kroplę macierzy błony zewnątrzkomórkowej zawierającej białka i czynniki wzrostu do każdej neurosfery.
Inkubuj, aby matryca zestaliła się, osadzając w niej neurosfery.
Teraz przenieś neurosfery osadzone w macierzy za pomocą pożywki neurosfery na płytkę hodowlaną zawierającą pożywki neurosferyczne.
Inkubować. Macierz błony zewnątrzkomórkowej i jej składniki ułatwiają różnicowanie neuroepitelialnych komórek progenitorowych w komórki neuronabłonkowe, które proliferują i tworzą wypełnione płynem światła.
Po inkubacji przenieś neurosfery do kolby obrotowej zawierającej wstępnie podgrzane pożywki organoidowe mózgu. Inkubuj z mieszaniem w celu zwiększenia dyfuzji tlenu i składników odżywczych, promując wzrost komórek.
Czynniki wzrostu i inhibitory małych cząsteczek w pożywkach sprzyjają różnicowaniu neuronów i przekształcają się w komórki określonych regionów mózgu, tworząc dojrzałe organoidy mózgowe.
Aby rozpocząć tę procedurę, zbierz neurosfery za pomocą mikropipety o pojemności 200 mikrolitrów, używając 2-milimetrowej końcówki uprzednio przeciętej sterylnymi nożyczkami. Następnie umieść neurosfery w odległości około 5 milimetrów od siebie na folii parafinowej w 100-milimetrowym naczyniu i ostrożnie usuń jak najwięcej pozostałego podłoża. Następnie dodaj kroplę matrycy EHS do każdej pojedynczej neurosfery.
Inkubuj krople matrycy EHS z neurosferami przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie ostrożnie umyj neurosfery z filmu parafinowego, spłukując je podłożem neurosfery. Następnie inkubuj neurosfery przez następne cztery dni i dodaj 2 mililitry świeżej pożywki neurosferycznej drugiego dnia.
W tej procedurze dodaj 100 mililitrów pożywki z organoidów mózgowych do każdej kolby obrotowej przez jej boczne ramiona i wstępnie podgrzej pożywkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej 20 minut. Następnie upewnij się, że wszystkie neurosfery są oddzielone. Jeśli dwie lub więcej jest połączonych za pomocą matrycy EHS, rozdziel je, przecinając macierz łączącą skalpelem.
Ustaw program mieszania na 25 obr./min. Ostrożnie przenieś neurosfery osadzone w matrycy EHS do kolb obrotowych zawierających 100 mililitrów podłoża organoidowego. Następnie umieść kolby obrotowe na mieszadle magnetycznym w inkubatorze na 14 dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza. To jest dzień zero hodowli organoidów. Zmieniaj podłoże raz w tygodniu, usuwając połowę podłoża i dodając taką samą ilość świeżego podłoża.