Technika pośredniej kohodowli neuronów i astrocytów do badania interakcji neuron-glej

Zacznij od płytki wielodołkowej zawierającej przepuszczalną wkładkę membranową pokrytą poli-D-lizyną.

Dodaj pożywkę wzrostu astrocytów do studzienki i zasiew astrocytów, wyspecjalizowanej komórki glejowej, do wkładki.

Inkubować, aby umożliwić przyleganie komórek do poli-D-lizyny poprzez oddziaływania elektrostatyczne i utworzyć monowarstwę.

Zastąp pożywkę astrocytów pożywką do hodowli neuronów.

Przenieść tę wkładkę do płytki wielodołkowej zawierającej przylegające pierwotne neurony embrionalne myszy na szkiełku nakrywkowym pokrytym polimerem.

Inkubuj w celu ustanowienia pośredniej kohodowli neuronów i astrocytów, w której dwa typy komórek są fizycznie oddzielone, ale mają tę samą pożywkę hodowlaną.

Astrocyty wydzielają różne czynniki neurotroficzne niezbędne do przetrwania i wzrostu neuronów.

Czynniki te migrują przez przepuszczalne podparcie i oddziałują z neuronami pierwotnymi. Sprzyja to ich różnicowaniu i tworzy projekcje neuronalne.

Projekcje te wydłużają się i ustanawiają połączenia synaptyczne między neuronami, wskazując na interakcje neuron-glej.

Pokryj każdą wkładkę 10 mikrogramami na mililitr poli-D-lizyny i inkubuj przez godzinę. Po godzinie umyj wkładki dwukrotnie PBS.

W międzyczasie odessać pożywkę astrocytów i przemyć kulturę raz 10 mililitrami PBS, aby upewnić się, że resztki surowicy zostały usunięte. Następnie dodaj 3 mililitry 0,05% trypsyny EDTA do kolb i inkubuj komórki do trypsynizacji przez około 10 minut. Następnie delikatnie zawieś komórki w 7 mililitrach pożywki astrocytowej.

Przenieś zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej probówki i wiruj przez pięć minut w temperaturze 216 razy g. Następnie ostrożnie zaaspiruj supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy w 1 mililitrze pożywki astrocytowej. Policz komórki za pomocą komory liczącej. Następnie napełnij 24-dołkową płytkę 500 mikrolitrami pożywki astrocytowej na dołek. Odessać PBS i przenieść 25 000 komórek w 500 mikrolitrach pożywki astrocytowej do każdej pojedynczej wstawki i inkubować kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Aby wypreparować hipokampy, przygotuj trzy 10-centymetrowe naczynia wypełnione pożywką i jedną 2-mililitrową tubkę z 1 mililitrem pożywki. Wypreparuj hipokampy z ugrupowań kory mózgowej i zbierz je do 2-mililitrowej probówki wypełnionej pożywką preparatyczną.

Bardzo ważne jest, aby hipokamp został odizolowany bez żadnych sąsiednich tkanek z innych regionów OUN. Dlatego po usunięciu hipokampa obce tkanki zanieczyszczające muszą zostać dodatkowo usunięte.

Po rozbiorze przenieść probówkę do sterylnego stanowiska z przepływem laminarnym. Ostrożnie usunąć pożywkę i strawić tkankę hipokampa za pomocą 1 mililitra roztworu trawiącego zawierającego papainę. Po 15 minutach trawienia ostrożnie odciągnij roztwór wytrawiający, delikatnie odsysając pipetą.

Ze względu na wysoką czułość neuronu bardzo ważne jest, aby ostrożnie rozcierać hipokampy, aby uniknąć pęcherzyków i uzyskać optymalną intensywność tryturacji.

Umyj hipokampy trzykrotnie pożywką neuronową, dodając i ostrożnie zasysając 1 mililitr świeżej pożywki hodowlanej na cykl mycia. Po ostatnim etapie płukania ostrożnie rozcieraj tkankę w 1 mililitrze pożywki neuronowej. Następnie policz komórki za pomocą komory liczącej. Umieść 35 000 komórek w 500 mikrolitrach pożywki neuronowej na dołek 24-dołkowej płytki i inkubuj neurony w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.

Teraz wyjmij z inkubatora przygotowane wkładki, które zostały wysiane zlewającymi się monowarstwami astrocytów. Wymień pożywkę, odsysając pożywkę astrocytów i zastępując ją 500 mikrolitrami świeżej pożywki neuronowej.

Następnie ostrożnie umieść wkładki z astrocytami w studzienkach zawierających kultury neuronów za pomocą sterylnych kleszczy. Następnie umieść powstałą pośrednią kokulturę astrocytów neuronów z powrotem w inkubatorze do czasu eksperymentów.