Selektywne usuwanie mikrogleju z hodowli neuronów granulatu móżdżku szczura

Weź zebrany móżdżek szczura i posiekaj go na kawałki.

Przenieś fragmenty do probówki zawierającej trypsynę i inkubuj.

Trypsyna trawi macierz zewnątrzkomórkową tkanki, rozluźniając neurony ziarniste móżdżku, a także komórki nieneuronalne, takie jak mikroglej i astrocyty.

Dodać bufor zawierający inhibitor trypsyny i DNazę. Inhibitor inaktywuje trypsynę, podczas gdy DNaza degraduje zanieczyszczające DNA.

Odwirować i wyrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić tkankę w buforze zawierającym inhibitor i DNazę i mechanicznie ją zdysocjować, tworząc zawiesinę jednokomórkową.

Zawiesinę nałożyć na roztwór buforowy zawierający białko.

Odwirować i wyrzucić supernatant zawierający resztki komórkowe.

Ponownie zawieś komórki w pożywce i umieść je na szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-L-lizyną, aby ułatwić przyczepienie komórkowe.

Wyjmij nośnik. Umyj komórki świeżą pożywką, a następnie dodaj pożywkę zawierającą inhibitor cyklu komórkowego, aby zapobiec proliferacji komórek glejowych.

Zastąp połowę pożywki świeżą pożywką zawierającą inhibitor lizosomów.

Inhibitor selektywnie oddziałuje na mikroglej i rozrywa błony lizosomalne, powodując śmierć mikrogleju i usunięcie go z hodowli.

Rozpocznij tę procedurę od zebrania móżdżku od cztero- do siedmiodniowych szczeniąt szczurów. Umieść je natychmiast na szalce Petriego zawierającej pięć mililitrów roztworu A na lodzie. Następnie usuń nadmiar roztworu z móżdżku i umieść tkankę w pokrywie szalki Petriego. Następnie drobno posiekaj tkankę dobrze podpaloną żyletką w co najmniej trzech różnych kierunkach.

Następnie dodaj posiekaną tkankę do roztworu B. Umieść ją w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na pięć minut i delikatnie potrząsaj co kilka minut. Następnie dodaj 20 mililitrów roztworu D do probówki, aby zneutralizować trypsynę. Wstrząsnąć i odwirować przy 65 g przez pięć minut. Następnie odlej supernatant. Zawiesić go ponownie w czterech mililitrach roztworu C.

Próbkę należy rozcierać 10 razy każdą z trzech pipet ze szkła płomieniowanego o zmniejszającej się średnicy, aż zawiesina będzie możliwie najbardziej jednorodna. Następnie powoli i delikatnie dodaj kilka kropli tego homogenatu na wierzch BSA-EBSS. Jeśli zacznie tonąć przez BSA-EBSS, rozcieraj więcej i dodaj trochę więcej roztworu C. Homogenat powinien znajdować się w warstwie na wierzchu BSA-EBSS.

Wiruj z prędkością 100 g przez pięć minut i nie potrząsaj. Następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki MEM. Policz komórki za pomocą hemocytometru i umieść je w 800 000 komórek na szkiełko nakrywkowe w 500 mikrolitrach pożywki MEM. Następnie umieść je w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 6% dwutlenkiem węgla. Następnie przygotuj roztwór pożywki MEM zawierającej 10 mikromoli inhibitora cyklu komórkowego, AraC.

Dla każdego szkiełka nakrywkowego zachowaj 250 mikrolitrów starej pożywki na świeżej 24-dołkowej płytce i odessaj resztę. Dodaj 250 mikrolitrów normalnej pożywki MEM, aby przepłukać komórki. Następnie dodaj 250 mikrolitrów starej pożywki z powrotem do komórek i uzupełnij 250 mikrolitrami pożywki zawierającej AraC.

W tej procedurze dodaj czystą LME do pięciu mililitrów pożywki MEM, aby uzyskać końcowe stężenie 150 milimolowych LME. Przywrócić roztwór do pH 7,4 za pomocą roztworu kwasowo-zasadowego. Następnie sterylnie przefiltruj go za pomocą 28-milimetrowego PES z filtrem strzykawkowym 0,2 mikrometra.

Następnie rozcieńczyć roztwór LME do stężenia 50 milimolów w pożywce MEM. Następnie umieść go w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 minut, wraz z normalną pożywką MEM do kultur kontrolnych. Po 10 minutach usuń 250 mikrolitrów pożywki MEM z każdej kultury CGC. Następnie utrzymuj podłoże w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie potraktuj komórki pożywką MEM zawierającą dwa razy LME lub wstępnie podgrzaną pożywką MEM bez LME dla kultur kontrolnych. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze z 6% dwutlenkiem węgla przez godzinę. Następnie umyj komórki dwukrotnie w świeżym, wstępnie podgrzanym pożywce MEM, aby usunąć pożywkę zawierającą LME.

Następnie zastąp zachowaną pożywkę hodowlaną równą ilością świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki MEM. Na koniec inkubuj kultury w 6% nawilżonym dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza.