Selektywne usuwanie mikrogleju z hodowli neuronów granulatu móżdżku szczura

Weź zebrany móżdżek szczura i posiekaj go na kawałki.

Przenieś fragmenty do probówki zawierającej trypsynę i inkubuj.

Trypsyna trawi macierz zewnątrzkomórkową tkanki, rozluźniając neurony ziarniste móżdżku, a także komórki nieneuronalne, takie jak mikroglej i astrocyty.

Dodać bufor zawierający inhibitor trypsyny i DNazę. Inhibitor inaktywuje trypsynę, podczas gdy DNaza degraduje zanieczyszczające DNA.

Odwirować i wyrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić tkankę w buforze zawierającym inhibitor i DNazę i mechanicznie ją zdysocjować, tworząc zawiesinę jednokomórkową.

Zawiesinę nałożyć na roztwór buforowy zawierający białko.

Odwirować i wyrzucić supernatant zawierający resztki komórkowe.

Ponownie zawieś komórki w pożywce i umieść je na szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-L-lizyną, aby ułatwić przyczepienie komórkowe.

Wyjmij nośnik. Umyj komórki świeżą pożywką, a następnie dodaj pożywkę zawierającą inhibitor cyklu komórkowego, aby zapobiec proliferacji komórek glejowych.

Zastąp połowę pożywki świeżą pożywką zawierającą inhibitor lizosomów.

Inhibitor selektywnie oddziałuje na mikroglej i rozrywa błony lizosomalne, powodując śmierć mikrogleju i usunięcie go z hodowli.

Rozpocznij tę proc