Typowanie DNA szczepów Mycobacterium leprae z wykorzystaniem zmiennej liczby powtórzeń tandemowych (VNTR) – analiza długości fragmentów (FLA)

Ogólnym celem tej procedury jest opracowanie charakterystycznego profilu DNA (odcisku palca DNA) Mycobacterium leprae, niehodowlanej bakterii wywołującej trąd, bezpośrednio z próbek klinicznych. Bakteryjne DNA M. leprae wyizolowane z biopsji pacjentów jest amplifikowane za pomocą wielokrotnego PCR z użyciem fluorescencyjnych starterów specyficznych dla loci o zmiennej liczbie powtórzeń tandemowych (VNTR). Po amplifikacji DNA przeprowadzana jest elektroforeza kapilarna w celu analizy długości fragmentów.

Dane są analizowane w celu określenia liczby krótkich tandemowych powtórzeń DNA w każdym locusie. Ponieważ różne szczepy EPRI wykazują różną liczbę powtórzeń tandemowych w każdym locusie, dane z wielu locusów pozwalają na uzyskanie unikalnych odcisków palca DNA, co umożliwia stworzenie bazy danych typów szczepów pacjentów przy użyciu tej techniki.

Strukturę populacyjną, ewolucję i transmisję trądu między pacjentami w określonych społecznościach oraz w skali globalnej można scharakteryzować, co w ostateczności dostarczy narzędzi genetycznych i dowodów niezbędnych do eliminacji trądu. Metoda ta może być wykorzystana do śledzenia rozprzestrzeniania się trądu, identyfikacji ognisk niedawnych zakażeń i osób z grup ryzyka oraz do pomiaru skuteczności programów kontrolnych. Procedurę zaprezentują Lee i Ron Jensen, badacze z mojego laboratorium, oraz Jason Rivers z naszego centralnego zaplecza aparatury: izolacja DNA z biopsji klinicznych przy użyciu standardowego zestawu do ekstrakcji DNA KaiGen.

Po uzyskaniu DNA należy przygotować nowy obszar roboczy w czystej komorze PCR. Aby uniknąć kontaminacji DNA, należy przemyć komorę oraz zestaw pipet 70% etanolem, a następnie naświetlać komorę i pipety światłem UV przez 15 minut. Po oczyszczeniu komory można przystąpić do przygotowania wieloodczynikowej reakcji PCR (multiplex PCR); dla każdej takiej reakcji stosuje się od czterech do pięciu par starterów, z których jeden starter w każdej parze jest znakowany fluorescencyjnie.

Należy wymieszać. Do przygotowania mieszanin starterów należy użyć zapasów starterów o stężeniu 10 µM przygotowanych w buforze TE. W jednej probce typu Eppendorf należy zmieszać równe ilości wszystkich starterów forward lub górnych, aby uzyskać końcowe stężenie 2 µM. W razie potrzeby należy dodać bufor TE dla każdego startera.

W innym probówce wymieszaj wszystkie primery odwrotne lub dolne w ten sam sposób. Po przygotowaniu mieszanin primerów, przygotuj mieszaninę PCR MES. Sporządź schemat płytki z opisem wszystkich próbek i kontroli dla każdej próbki.

Mieszanina master mix powinna zawierać 12 µL mieszaniny do multiplex PCR KaiGen, dwa µL każdej puli starterów oraz dwa µL roztworu Q. Należy przygotować wystarczającą ilość master mix, aby uwzględnić kontrole oraz straty podczas pipetowania. Krótko odwiruj master mix w wirówce.

Następnie nanieś 18 µL master mixu do każdej studzienki płyty PCR. Aby uniknąć kontaminacji próbek DNA, zmień rękawiczki, przetrzyj i zdezynfekuj oddzielną komorę z laminarnym przepływem powietrza. Podobnie jak poprzednio, po odkazieniu komory przenieś płytę do tej komory.

Następnie do każdego dołka zawierającego master mix należy dodać 2 µL próbki DNA. W celu uniknięcia kontaminacji krzyżowej należy używać końcówek do pipet z filtrem zapobiegającym przedostawaniu się aerozoli. Płytki PCR należy szczelnie zamknąć i krótko odwirować, aby wymieszać zawartość.

Następnie umieść płytkę reakcyjną w termocyklerze i uruchom program PCR dla przesyłanych próbek. W przypadku FLA przygotuj formamid, master mix i dodaj rozcieńczone produkty PCR do czystej probówki Eppendorf, łącząc 12 µL roztworu formamidu oraz 0,3 µL standardu wielkości GeneScan 500 LID na każdą badaną próbkę. Rozdziel 12,3 µL tego roztworu do każdej studzienki optycznej płytki reakcyjnej o 96 studzienkach.

Po zakończeniu reakcji PCR płytkę wirujemy w wirówce. Należy upewnić się, że pozycja każdej próbki została odnotowana na mapie płytki. Następnie w oddzielnej płytce 96-dołkowej odmierza się 59 µL wody wolnej od nukleaz do każdego dołka i dodaje jeden µL każdej reakcji PCR do odpowiedniego dołka, aby rozcieńczyć amplifikowany DNA w stosunku 1:60.

Po rozcieńczeniu DNA należy użyć pipety wielokanałowej, aby przenieść 1 µL każdej rozcieńczonej próbki PCR do odpowiadającej studni płytki zawierającej roztwór formamidowy. Po zakończeniu programu próbki można poddać standardowej elektroforezie w żelu agarozowym, aby potwierdzić amplifikację fragmentów DNA o przewidywanych rozmiarach. Próbki są przygotowywane do analizy metodą fluorescencyjnej elektroforezy kapilarnej przy użyciu analizatora genetycznego FLA; przed analizą należy nałożyć na płytkę septę i krótko odwirować, aby usunąć pęcherzyki powietrza i osadzić próbkę na dnie studni.

Dlatego IDE przeprowadzi chemiczną denaturację nici, dzięki czemu nie ma potrzeby stosowania denaturacji termicznej. Umieść płytkę w tacy do ładowania. Przeanalizuj oznakowany produkt PCR za pomocą elektroforezy kapilarnej, np. przy użyciu analizatora genetycznego ABBI 3130 xl.

Próbki należy analizować przy użyciu kapilary o długości 50 centimeter wypełnionej polimerem pop seven jako medium separującym. DNA migruje w stronę końca kapilary, gdzie laser i detektor mierzą znaczniki fluorescencyjne; należy otworzyć oprogramowanie zbierające dane analizatora. Przed analizą próbek analizator musi zostać skalibrowany w celu wykrywania wszystkich użytych barwników, w tym standardu wielkości; standardem dset zastosowanym dla tych próbek jest ABIs G five Dissect. Próbki są wstrzykiwane elektrokinetycznie przy napięciu 1,6 kilovolts przez 15 seconds.

Rozdziel fragmenty, przykładając napięcie 15 kilowoltów przez 1800 sekund. Całkowity czas każdego przebiegu wynosi około 45 minut. Po zakończeniu przebiegu utwórz pliki danych dla każdej próbki.

Pliki są umieszczane w folderze płytki przez oprogramowanie zbierające analizatora w określonej lokalizacji. Pliki są w formacie FSA. Dane FLA mogą być analizowane za pomocą oprogramowania peak scanner, które jest bezpłatnie dostępne na stronie internetowej firmy Applied Biosystems.

Aby przeanalizować dane, kliknij „start new project”, a następnie „add files”. Załaduj do programu wybrane pliki z danymi, w tym kontrole pozytywne i negatywne. Wybierz i przeanalizuj załadowane pliki.

Wyniki przedstawiono w formie chromatogramu FLA. Standardy wielkości widoczne są jako pomarańczowe piki, natomiast kolorowe piki reprezentują bakteryjne próbki DNA dla każdego locus analizowanego w próbce; kliknij w pik, aby określić jego wielkość w parach zasad. Ze względu na syntezę z poślizgiem nici polimerazy DNA, dla niektórych loci mikrosatelitarnych zostanie wykryta rodzina pików tego samego koloru.

W takich przypadkach za wybrany pik uznaje się zazwyczaj ten o największej amplitudzie. Należy porównać wielkości fragmentów w każdej próbce z wielkością kontroli pozytywnej, aby określić liczbę segmentów powtórzeń tandemowych dla każdego badanego allelu, a następnie wpisać dane do arkusza Excel w celu dalszej analizy. Na tej rycinie przedstawiono odciski genetyczne DNA izolatów od siedmiu pacjentów z trzech różnych rodzin z tej samej wioski oraz wskazano liczbę powtórzeń tandemowych dla każdego analizowanego locus polimorficznego.

Dane te sugerują, że dwóch członków rodziny be jest zakażonych tym samym szczepem, podczas gdy jeden członek jest zakażony odrębnym szczepem. Członkowie rodzin C są prawdopodobnie zakażeni tym samym szczepem. Podobnie jest w przypadku członków rodziny A. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak rutynowo stosować multiplex PCR oraz analizę długości fragmentów w celu uzyskania odcisków palców V-N-T-R-D-N-A u pacjentów z trądem zgłaszających się do klinik.

Są to nowoczesne narzędzia molekularne, które stanowią uzupełnienie konwencjonalnej epidemiologii w ramach zwalczania trądu.