Name: Odciski palców DNA szczepów Mycobacterium leprae przy użyciu powtarzania tandemowego o zmiennej liczbie (VNTR) - analiza długości fragmentów (FLA) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Poznaj metodę odcisków palców DNA Mycobacterium leprae przy użyciu analizy długości fragmentów VNTR. Technika ta umożliwia śledzenie transmisji trądu i identyfikację ognisk zakażeń w populacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie zostało zapewnione z grantu NIH/NIAID RO1-AI-63457 oraz suplementu do grantu ARRA RO1-AI-63457 S1. Wyrażamy wdzięczność za wkład wszystkich obecnych i byłych członków grupy laboratoryjnej oraz współpracowników.

<ol><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+of+leprosy+for+control+programmes%5BTitle%5D)+AND+%22Technical+Report+Series%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy of leprosy for control programmes.</a> Technical Report Series. 675, 18-22 (1982).</li>
<li>Cole, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+gene+decay+in+the+leprosy+bacillus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Massive gene decay in the leprosy bacillus.</a> Nature. 409, 1007-1011 (2001).</li>
<li>Leproma Web Server. Leproma Web Server [Internet]. , Available from: http://genolist.pasteur.fr/Leproma/ (2004).</li>
<li>Groathouse, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Polymorphic+Loci+for+Molecular+Typing+of+Strains+of+Mycobacterium+leprae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multiple Polymorphic Loci for Molecular Typing of Strains of Mycobacterium leprae.</a> J. of Clinical Microbiology. 42, 1666-1672 (2004).</li>
<li>Young, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Short+Tandem+Repeat+Sequences+to+Study+Mycobacterium+leprae+in+Leprosy+Patients+in+Malawi+and+India%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science%3A+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Use of Short Tandem Repeat Sequences to Study Mycobacterium leprae in Leprosy Patients in Malawi and India.</a> Public Library of Science: Neglected Tropical Diseases. 2, E214-E214 (2008).</li>
<li>Monot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+Variable-Number+Tandem+Repeats+Appropriate+for+Genotyping+Mycobacterium+leprae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Are Variable-Number Tandem Repeats Appropriate for Genotyping Mycobacterium leprae.</a> J. of Clinical Microbiology. 46, 2291-2297 (2008).</li>
<li>Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Variable+Number+Tandem-Repeat+Genotyping+for+Mycobacterium+leprae+Clinical+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid Variable Number Tandem-Repeat Genotyping for Mycobacterium leprae Clinical Specimens.</a> J. of Clinical Microbiology. 47, 1757-1766 (2009).</li>
<li>Weng, X. iaoman <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Distribution+of+Mycobacterium+leprae+Genotypes+in+a+Region+of+High+Leprosy+Prevalence+in+China%3A+a+3-Year+Molecular+Epidemiological+Study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification and Distribution of Mycobacterium leprae Genotypes in a Region of High Leprosy Prevalence in China: a 3-Year Molecular Epidemiological Study.</a> J. of Clinical Microbiology. 45, 1728-1734 (2007).</li>
<li>Weng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+leprosy+in+Qiubei+County%2C+Yunnan%2C+China%3A+Insights+from+an+eight+year+molecular+epidemiology+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Infection%2C+Genetics+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Transmission of leprosy in Qiubei County, Yunnan, China: Insights from an eight year molecular epidemiology investigation.</a> Infection, Genetics and Evolution. , (2010).</li>
<li>Sakamuri, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population-Based+Molecular+Epidemiology+of+Leprosy+in+Cebu%2C+Philippines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Population-Based Molecular Epidemiology of Leprosy in Cebu, Philippines.</a> J. of Clinical Microbiology. 47, 2844-2854 (2009).</li>
<li>Fontes, A. N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+diversity+of+Mycobacterium+leprae+isolates+from+Brazilian+leprosy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Leprosy+Review%22%5BJournal%5D)">Genetic diversity of Mycobacterium leprae isolates from Brazilian leprosy patients.</a> Leprosy Review. 80, 302-315 (2009).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Pobieranie próbek skóry od pacjentów z trądem wymaga udziału wykwalifikowanych klinicystów lub techników pracujących w klinikach dermatologicznych. Pracownicy laboratoryjni zajmujący się tymi próbkami muszą z najwyższą starannością stosować fartuchy laboratoryjne, rękawiczki oraz ochronę oczu, a podczas pracy z zakażonymi próbkami tkanek ludzkich lub tkanek pancernika korzystać z komory bezpiecznej biologicznie. Kluczowe jest również odkażanie powierzchni i narzędzi. Praca w czystej, sterylnej komorze bezpiecznej biologicznie jest istotna dla uniknięcia kontaminacji próbek DNA.
Ekstrakcja DNA stała się stosunkowo łatwa dzięki opracowaniu zestawów do izolacji przez firmy takie jak Qiagen. Należy ściśle przestrzegać instrukcji. Wszystkie próbki powinny być przechowywane w niskiej temperaturze, gdy nie są używane. Należy unikać wielokrotnych, gwałtownych zmian temperatury próbek.
Startery DNA wykorzystane w tej pracy można zamówić w różnych firmach, które zostały wymienione w bibliografii na końcu niniejszej publikacji. Należy zachować szczególną ostrożność i pracować ze starterami w środowisku wolnym od DNA, aby uniknąć kontaminacji. Startery są dostarczane w formie suchego proszku i muszą zostać rozpuszczone w buforze TE i rozcieńczone do stężenia 100μM, a następnie podzielone na mniejsze aلیکwoty (Rysunek 2a). Roztwory robocze starterów są następnie rozcieńczane do stężenia 10μM. Ponownie przypominamy, aby nie używać próbek DNA w obszarach lub dygestoriach, w których przygotowywane i stosowane są startery.
Produkty PCR powinny być również przechowywane w niskiej temperaturze, gdy nie są używane.
Przygotowanie żelu agarozowego o stężeniu 3% zapewnia lepszą separację prążków DNA, lecz wymaga dłuższego czasu elektroforezy. W celach czysto jakościowych zazwyczaj wystarczające jest stężenie 2%. Roztwór bromku etydyny stosowany do barwienia DNA w żelach agarozowych jest silnie aktywną genotoksyną, która wchłania się przez skórę. Należy obchodzić się z tym roztworem oraz z zabarwionymi nim żelami z ogromną ostrożnością, zawsze pamiętając o noszeniu rękawiczek. Po pracy z jakimikolwiek próbkami DNA lub materiałami zawierającymi bromek etydyny należy dokładnie umyć ręce. Roztwór barwiący z bromkiem etydyny, roztwory płuczące oraz żele należy utylizować zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Żele nie są wymagane rutynowo; ten krok można pominąć po ustanowieniu metod FLA. Jest on czasochłonny i zużywa odczynniki.
Roztwór formamidu stosowany do przygotowywania próbek do FLA jest również wysoce toksyczny i należy z nim obchodzić się ostrożnie. Po jego użyciu należy umyć ręce. Utylizację przeprowadzić zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
Odczytywanie wyników FLA przy użyciu oprogramowania Peak Scanner może być trudne. W CSU opracowano podstawowy zestaw oznaczeń alleli (liczba powtórzeń tandemowych) (Tabele 4-7). (Należy zauważyć, że Tabele 4-7 mogą nie być wyczerpujące. W miarę badania innych szczepów M. leprae mogą zostać znalezione allele z liczbą kopii wykraczającą poza wymienione zakresy). Jednym z szczególnych wyzwań są piki typu „stutter” (szum). Są to grupy pików, szczególnie w przypadku STR obejmujących powtórzenia zaledwie 2-3 par zasad, takich jak (TA)10. Czasami wybór właściwego piku do odczytu jest utrudniony (Rysunek 7). Na tym rysunku głównym pikiem w kontroli pozytywnej jest pik przy 190 bp. Piki o mniejszej wysokości, które są o 2, 4 lub nawet 6 par zasad większe lub mniejsze od piku głównego, nazywa się „pikami stutter”. Zamieszanie może również wprowadzić tzw. A-tailing. Zjawisko A-tailingu zostało opisane wcześniej w tekście oraz na Rysunku 8. Wreszcie, jeśli produkty PCR są w próbkach bardzo liczne, piki mogą pojawić się z podwójnym wierzchołkiem. W takim przypadku należy odczytać środek kształtu piku. (Patrz Rysunek 6, Pacjent 6).
Zarządzanie danymi w tego typu badaniach może być niezwykle wymagającym zadaniem. Ważne jest rejestrowanie wszystkich istotnych informacji dla każdego eksperymentu, takich jak: data wykonania zadania lub procedury, operator, mapy pasków/płytek, zamówienia FLA, warunki i składy mieszanin PCR, daty wykonania elektroforezy i wykonania zdjęć, temperatury przechowywania, rozcieńczenia matryc DNA, lokalizacje plików elektronicznych FLA itp. Dobra organizacja i zarządzanie danymi mogą zaoszczędzić wiele godzin poświęconych w przyszłości na poszukiwanie konkretnych informacji.
Opisane tutaj prace laboratoryjne są prowadzone od kilku lat na Colorado State University oraz w innych ośrodkach na całym świecie. Zaczyna wyłaniać się szerszy obraz tego, co oznaczają wszystkie zgromadzone dane i w jaki sposób mogą one być przydatne w przyszłości. Rysunki 10A oraz 10B pokazują, jak te odciski palców DNA mogą być wykorzystane do rozróżnienia różnych szczepów M. leprae pomiędzy krajami (10A) lub nawet pomiędzy rodzinami (10B). Wykazano, że przypadki powiązane rodzinie i społeczności niosą szczepy VNTR M. leprae o podobnych lub identycznych typach. Nadzieją jest, że uda się uzyskać dalszy wgląd w tryb(y) transmisji trądu, co pozwoli na opracowanie systemu wczesnego wykrywania sieci transmisji dla osób najbardziej narażonych oraz rozpoczęcie leczenia farmakologicznego przed wystąpieniem trwałych uszkodzeń neurologicznych i dermatologicznych.

typowanie dna szczepów mycobacterium leprae z wykorzystaniem zmiennej liczby powtórzeń tandemowych (vntr) – analiza długości fragmentów (fla)

DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA)

Badanie transmisji trądu jest szczególnie trudne, ponieważ czynnik etiologiczny, Mycobacterium leprae, nie może być hodowany w laboratorium. Jedynymi źródłami bakterii są pacjenci z trądem oraz eksperymentalnie zakażone pancerniki i myszy nude. W związku z tym wiele metod stosowanych we współczesnej epidemiologii nie jest dostępnych do badania trądu. Pomimo szeroko zakrojonego globalnego programu leczenia farmakologicznego trądu wdrożonego przez WHO1, choroba ta pozostaje endemiczna w wielu krajach, z około 250 000 nowych przypadków każdego roku.2 Cały genom M. leprae został zmapowany3,4, a zidentyfikowano wiele loci zawierających powtórzone segmenty o długości 2 lub więcej par zasad (tzw. mikrosatelity i minisatelity).5 Szczepy kliniczne M. leprae mogą różnić się liczbą tandemowych segmentów powtórzeń (krótkie powtórzenia tandemowe, STR) w wielu z tych loci.5,6,7 Analiza zmiennej liczby powtórzeń tandemowych (VNTR)5 jest wykorzystywana do rozróżniania różnych szczepów prątków trądu. Niektóre loci wydają się być bardziej stabilne od innych, wykazując mniejszą zmienność w liczbie powtórzeń, podczas gdy inne zmieniają się szybciej, niekiedy u tego samego pacjenta. Choć zmienność niektórych VNTR wzbudziła pytania dotyczące ich przydatności do typowania szczepów7,8,9, pojawiające się dane sugerują, że analiza wielu loci o różnym stopniu stabilności może służyć jako wartościowe narzędzie epidemiologiczne. Wielolocusowa analiza VNTR (MLVA)10 była stosowana do badania ewolucji i transmisji trądu w kilku krajach, w tym w Chinach11,12, Malawi8, na Filipinach10,13 i w Brazylii14. MLVA składa się z kilku etapów. Najpierw, z biopsji klinicznych lub rozmazów z nacięć skóry (SSS) ekstrahuje się DNA bakteryjne wraz z DNA tkanki gospodarza.10 Następnie pożądane loci są amplifikowane z wyekstrahowanego DNA za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). W jednej reakcji stosuje się startery znakowane fluorescencyjnie dla 4-5 różnych loci, a łącznie w czterech reakcjach amplifikuje się 18 loci.10 Produkty PCR mogą być poddawane elektroforezie w żelu agarozowym w celu weryfikacji obecności pożądanych fragmentów DNA, a następnie przekazywane do fluorescencyjnej analizy długości fragmentów (FLA) z wykorzystaniem elektroforezy kapilarnej. Jako kontrolę pozytywną stosuje się DNA z bakterii pasażowanych przez pancerniki o znanej liczbie kopii powtórzeń dla każdego locus. Chromatogramy FLA są następnie analizowane przy użyciu oprogramowania Peak Scanner, a długość fragmentu jest przeliczana na liczbę kopii VNTR (allela). Na koniec analizowane są wzorce haplotypów VNTR, które w połączeniu z danymi klinicznymi pacjentów mogą służyć do śledzenia dystrybucji typów szczepów.

Trąd, wywoływany przez Mycobacterium leprae, wciąż występuje endemicznie w wielu miejscach. Aby poznać sposób rozprzestrzeniania się i drogi przenoszenia trądu, istotne jest określenie, który szczep M. leprae zainfekował pacjenta. Typowanie z wykorzystaniem zmiennej liczby powtórzeń tandemowych (VNTR) jest jedną z takich metod.

Typowanie DNA szczepów Mycobacterium leprae z wykorzystaniem zmiennej liczby powtórzeń tandemowych (VNTR) – analiza długości fragmentów (FLA)

Badanie transmisji trądu jest szczególnie trudne, ponieważ czynnik etiologiczny, *Mycobacterium leprae*, nie może być hodowany w warunkach laboratoryjnych. ...

Ogólnym celem tej procedury jest opracowanie charakterystycznego profilu DNA (odcisku palca DNA) Mycobacterium leprae, niehodowlanej bakterii wywołującej trąd, bezpośrednio z próbek klinicznych. Bakteryjne DNA M. leprae wyizolowane z biopsji pacjentów jest amplifikowane za pomocą wielokrotnego PCR z użyciem fluorescencyjnych starterów specyficznych dla loci o zmiennej liczbie powtórzeń tandemowych (VNTR). Po amplifikacji DNA przeprowadzana jest elektroforeza kapilarna w celu analizy długości fragmentów.Dane są analizowane w celu określenia liczby krótkich tandemowych powtórzeń DNA w każdym locusie. Ponieważ różne szczepy EPRI wykazują różną liczbę powtórzeń tandemowych w każdym locusie, dane z wielu locusów pozwalają na uzyskanie unikalnych odcisków palca DNA, co umożliwia stworzenie bazy danych typów szczepów pacjentów przy użyciu tej techniki.Strukturę populacyjną, ewolucję i transmisję trądu między pacjentami w określonych społecznościach oraz w skali globalnej można scharakteryzować, co w ostateczności dostarczy narzędzi genetycznych i dowodów niezbędnych do eliminacji trądu. Metoda ta może być wykorzystana do śledzenia rozprzestrzeniania się trądu, identyfikacji ognisk niedawnych zakażeń i osób z grup ryzyka oraz do pomiaru skuteczności programów kontrolnych. Procedurę zaprezentują Lee i Ron Jensen, badacze z mojego laboratorium, oraz Jason Rivers z naszego centralnego zaplecza aparatury: izolacja DNA z biopsji klinicznych przy użyciu standardowego zestawu do ekstrakcji DNA KaiGen.Po uzyskaniu DNA należy przygotować nowy obszar roboczy w czystej komorze PCR. Aby uniknąć kontaminacji DNA, należy przemyć komorę oraz zestaw pipet 70% etanolem, a następnie naświetlać komorę i pipety światłem UV przez 15 minut. Po oczyszczeniu komory można przystąpić do przygotowania wieloodczynikowej reakcji PCR (multiplex PCR); dla każdej takiej reakcji stosuje się od czterech do pięciu par starterów, z których jeden starter w każdej parze jest znakowany fluorescencyjnie.Należy wymieszać. Do przygotowania mieszanin starterów należy użyć zapasów starterów o stężeniu 10 µM przygotowanych w buforze TE. W jednej probce typu Eppendorf należy zmieszać równe ilości wszystkich starterów forward lub górnych, aby uzyskać końcowe stężenie 2 µM. W razie potrzeby należy dodać bufor TE dla każdego startera.W innym probówce wymieszaj wszystkie primery odwrotne lub dolne w ten sam sposób. Po przygotowaniu mieszanin primerów, przygotuj mieszaninę PCR MES. Sporządź schemat płytki z opisem wszystkich próbek i kontroli dla każdej próbki.Mieszanina master mix powinna zawierać 12 µL mieszaniny do multiplex PCR KaiGen, dwa µL każdej puli starterów oraz dwa µL roztworu Q. Należy przygotować wystarczającą ilość master mix, aby uwzględnić kontrole oraz straty podczas pipetowania. Krótko odwiruj master mix w wirówce.Następnie nanieś 18 µL master mixu do każdej studzienki płyty PCR. Aby uniknąć kontaminacji próbek DNA, zmień rękawiczki, przetrzyj i zdezynfekuj oddzielną komorę z laminarnym przepływem powietrza. Podobnie jak poprzednio, po odkazieniu komory przenieś płytę do tej komory.Następnie do każdego dołka zawierającego master mix należy dodać 2 µL próbki DNA. W celu uniknięcia kontaminacji krzyżowej należy używać końcówek do pipet z filtrem zapobiegającym przedostawaniu się aerozoli. Płytki PCR należy szczelnie zamknąć i krótko odwirować, aby wymieszać zawartość.Następnie umieść płytkę reakcyjną w termocyklerze i uruchom program PCR dla przesyłanych próbek. W przypadku FLA przygotuj formamid, master mix i dodaj rozcieńczone produkty PCR do czystej probówki Eppendorf, łącząc 12 µL roztworu formamidu oraz 0,3 µL standardu wielkości GeneScan 500 LID na każdą badaną próbkę. Rozdziel 12,3 µL tego roztworu do każdej studzienki optycznej płytki reakcyjnej o 96 studzienkach.Po zakończeniu reakcji PCR płytkę wirujemy w wirówce. Należy upewnić się, że pozycja każdej próbki została odnotowana na mapie płytki. Następnie w oddzielnej płytce 96-dołkowej odmierza się 59 µL wody wolnej od nukleaz do każdego dołka i dodaje jeden µL każdej reakcji PCR do odpowiedniego dołka, aby rozcieńczyć amplifikowany DNA w stosunku 1:60.Po rozcieńczeniu DNA należy użyć pipety wielokanałowej, aby przenieść 1 µL każdej rozcieńczonej próbki PCR do odpowiadającej studni płytki zawierającej roztwór formamidowy. Po zakończeniu programu próbki można poddać standardowej elektroforezie w żelu agarozowym, aby potwierdzić amplifikację fragmentów DNA o przewidywanych rozmiarach. Próbki są przygotowywane do analizy metodą fluorescencyjnej elektroforezy kapilarnej przy użyciu analizatora genetycznego FLA; przed analizą należy nałożyć na płytkę septę i krótko odwirować, aby usunąć pęcherzyki powietrza i osadzić próbkę na dnie studni.Dlatego IDE przeprowadzi chemiczną denaturację nici, dzięki czemu nie ma potrzeby stosowania denaturacji termicznej. Umieść płytkę w tacy do ładowania. Przeanalizuj oznakowany produkt PCR za pomocą elektroforezy kapilarnej, np. przy użyciu analizatora genetycznego ABBI 3130 xl.Próbki należy analizować przy użyciu kapilary o długości 50 centimeter wypełnionej polimerem pop seven jako medium separującym. DNA migruje w stronę końca kapilary, gdzie laser i detektor mierzą znaczniki fluorescencyjne; należy otworzyć oprogramowanie zbierające dane analizatora. Przed analizą próbek analizator musi zostać skalibrowany w celu wykrywania wszystkich użytych barwników, w tym standardu wielkości; standardem dset zastosowanym dla tych próbek jest ABIs G five Dissect. Próbki są wstrzykiwane elektrokinetycznie przy napięciu 1,6 kilovolts przez 15 seconds.Rozdziel fragmenty, przykładając napięcie 15 kilowoltów przez 1800 sekund. Całkowity czas każdego przebiegu wynosi około 45 minut. Po zakończeniu przebiegu utwórz pliki danych dla każdej próbki.Pliki są umieszczane w folderze płytki przez oprogramowanie zbierające analizatora w określonej lokalizacji. Pliki są w formacie FSA. Dane FLA mogą być analizowane za pomocą oprogramowania peak scanner, które jest bezpłatnie dostępne na stronie internetowej firmy Applied Biosystems.Aby przeanalizować dane, kliknij „start new project”, a następnie „add files”. Załaduj do programu wybrane pliki z danymi, w tym kontrole pozytywne i negatywne. Wybierz i przeanalizuj załadowane pliki.Wyniki przedstawiono w formie chromatogramu FLA. Standardy wielkości widoczne są jako pomarańczowe piki, natomiast kolorowe piki reprezentują bakteryjne próbki DNA dla każdego locus analizowanego w próbce; kliknij w pik, aby określić jego wielkość w parach zasad. Ze względu na syntezę z poślizgiem nici polimerazy DNA, dla niektórych loci mikrosatelitarnych zostanie wykryta rodzina pików tego samego koloru.W takich przypadkach za wybrany pik uznaje się zazwyczaj ten o największej amplitudzie. Należy porównać wielkości fragmentów w każdej próbce z wielkością kontroli pozytywnej, aby określić liczbę segmentów powtórzeń tandemowych dla każdego badanego allelu, a następnie wpisać dane do arkusza Excel w celu dalszej analizy. Na tej rycinie przedstawiono odciski genetyczne DNA izolatów od siedmiu pacjentów z trzech różnych rodzin z tej samej wioski oraz wskazano liczbę powtórzeń tandemowych dla każdego analizowanego locus polimorficznego.Dane te sugerują, że dwóch członków rodziny be jest zakażonych tym samym szczepem, podczas gdy jeden członek jest zakażony odrębnym szczepem. Członkowie rodzin C są prawdopodobnie zakażeni tym samym szczepem. Podobnie jest w przypadku członków rodziny A. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak rutynowo stosować multiplex PCR oraz analizę długości fragmentów w celu uzyskania odcisków palców V-N-T-R-D-N-A u pacjentów z trądem zgłaszających się do klinik.Są to nowoczesne narzędzia molekularne, które stanowią uzupełnienie konwencjonalnej epidemiologii w ramach zwalczania trądu.

dna-fingerprinting-mycobacterium-leprae-strains-using-variable-number

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Analiza linii DNA Mycobacterium leprae za pomocą zmiennej liczby tandemowych powtórzeń (VNTR) - Analiza długości fragmentów (FLA)

Przedstawiamy nieinwazyjne podejście do pobierania próbek, umożliwiające efektywne gromadzenie próbek sierści od płochliwych małych ssaków, co zaprezentowano na przykładzie piki amerykańskiej. Wykazujemy użyteczność tej metody poprzez ekstrakcję DNA z pobranej sierści oraz amplifikację kilku typów markerów molekularnych powszechnie stosowanych w badaniach nad ekologią i ochroną dzikiej przyrody.

Nieinwazyjna technika pobierania próbek sierści w celu pozyskania wysokiej jakości DNA od trudnych do uchwycenia małych ssaków

Źródło: Gulla, S. i inni. Wielolokusowa analiza powtórzeń o zmiennej liczbie dla bakterii patogennej ryb Yersinia ruckeri za pomocą multiplex PCR i kapilarnej elektroforezy. J. Vis. Exp. (2019).Ten film pokazuje procedurę rozdzielania fluorescencyjnie znakowanych amplikonów o zmiennej liczbie powtórzeń tandemowych (VNTR), pochodzących z bakterii patogennej ryb, przy użyciu elektroforezy kapilarnej do generowania profili elektroferograficznych specyficznych dla rozmiaru do identyfikacji bakterii.

Wykrywanie patogenów ryb za pomocą analizy powtarzania tandemowego o zmiennej liczbie (VNTR)

Mikromacierz amplifikacyjna łączy asymetryczną amplifikację PCR i hybrydyzację mikromacierzy w jednej komorze, co znacznie usprawnia pracę z mikromacierzą dla użytkownika końcowego. Uproszczenie przepływu pracy z mikromacierzami jest niezbędnym pierwszym krokiem do stworzenia diagnostyki opartej na mikromacierzach, która może być rutynowo używana w środowiskach o niższych zasobach.

Demonstracja wielolekoopornej mikromacierzy amplifikacyjnej Mycobacterium tuberculosis

Opisujemy zwięzłą procedurę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w gonadzie i zarodkach Caenorhabditis elegans w celu obserwacji i ilościowego określenia powtarzających się sekwencji. Z powodzeniem zaobserwowaliśmy i określiliśmy ilościowo dwie różne powtarzające się sekwencje, powtórzenia telomerów i szablon alternatywnego wydłużania telomerów (TALT).

Obserwacja i kwantyfikacja telomerów i powtarzających się sekwencji za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) z sondami PNA w Caenorhabditis elegans

Opisana jest ulepszona metoda polimorfizmu długości fragmentów ograniczających reakcję łańcuchową polimerazy do genotypowania gatunków rozdymek za pomocą chromatografii cieczowej/spektrometrii mas. Kolumna monolitu krzemionkowego z odwróconymi fazami służy do oddzielania strawionych amplikonów. Metoda ta może wyjaśnić monoizotopowe masy oligonukleotydów, co jest przydatne do identyfikacji składu zasadowego.

Ulepszone polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych reakcji łańcuchowej polimerazy Genotypowanie toksycznych rozdymek za pomocą chromatografii cieczowej/spektrometrii mas

W tym artykule omówiono szczegółowy protokół do ilościowego określania długości telomerów za pomocą zmodyfikowanej analizy fragmentów restrykcyjnych na końcu, który zapewnia szybki i efektywny bezpośredni pomiar długości telomerów. Technika ta może być stosowana do różnych źródeł komórkowych DNA w celu ilościowego określenia długości telomerów.

Zmodyfikowana analiza końcowych fragmentów restrykcyjnych do ilościowego określania długości telomerów za pomocą hybrydyzacji w żelu

Prezentowany tutaj test wielomiejscowej analizy tandemowo-powtórzeniowej (MLVA) umożliwia niedrogie, solidne i przenośne genotypowanie w wysokiej rozdzielczości bakterii Yersinia ruckeri. Zaczynając od czystych kultur, test wykorzystuje multipleksową reakcję PCR i elektroforezę kapilarną w celu wytworzenia dziesięcioloci-loci profili MLVA do dalszych zastosowań.

Wielolocusowa analiza tandemowo-powtórzeniowa bakterii Yersinia ruckeri patogennej dla ryb metodą Multiplex PCR i elektroforezy kapilarnej

Tutaj opisujemy prosty protokół do generowania profili odcisków palców DNA poprzez amplifikację locus VNTR D1S80 z DNA komórki nabłonkowej.

Zastosowanie odcisków palców DNA przy użyciu locus D1S80 w klasach laboratoryjnych

Ten protokół jest skuteczną, szybką metodą hodowli drożdży i pleśni Aspergillus fumigatus z dużych zestawów próbek gleby w ciągu zaledwie 7 dni. Metody te można łatwo modyfikować w celu dostosowania do różnych pożywek inkubacyjnych i temperatur w zależności od potrzeb eksperymentów.

Izolacja drożdży i pleśni nadających się do hodowli z gleb w celu zbadania struktury populacji grzybów

W tym badaniu, aplikacja dot-blot została zaprojektowana do wykrywania Leptospira z trzech głównych kladów w próbkach wody. Metoda ta pozwala na identyfikację minimalnych ilości DNA specyficznie ukierunkowanych na sondę znakowaną digoksygeniną, łatwo wykrywalnych przez przeciwciało anty-digoksygeninowe. Takie podejście jest cennym i zadowalającym narzędziem do celów badań przesiewowych.

Reakcja łańcuchowa polimerazy i hybrydyzacja kropkowa do wykrywania Leptospira w próbkach wody

Poznaj metodę odcisków palców DNA Mycobacterium leprae przy użyciu analizy długości fragmentów VNTR. Technika ta umożliwia śledzenie transmisji trądu i identyfikację ognisk zakażeń w populacji.

Odciski palców DNA szczepów Mycobacterium leprae przy użyciu powtarzania tandemowego o zmiennej liczbie (VNTR) - analiza długości fragmentów (FLA) (Wideo) | JoVE Journal

Typowanie DNA szczepów Mycobacterium leprae z wykorzystaniem zmiennej liczby powtórzeń tandemowych (VNTR) – analiza długości fragmentów (FLA)

Przeglądaj więcej filmów