JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:03 min. • July 8th, 2025
Rozpocząć od dwóch płytek wielodołkowych: jednej z wytrawionym dnem pokrytym polimerem, a drugiej z szkiełkiem nakrywkowym pokrytym polimerem.
Umieść zawiesinę neuronów embrionalnych o dużej gęstości na płytce z wytrawionym dnem. Dodaj zawiesinę neuronów o bardzo niskiej gęstości do dobrze zawierającej szkiełko nakrywkowe.
Inkubuj, aby umożliwić neuronalne przyczepienie się do polimerów.
Usuń szkiełko nakrywkowe i umieść je na kulturze neuronów o dużej gęstości, umożliwiając neuronom zwrócenie się do siebie.
Wytrawiona powierzchnia z wypukłymi strukturami tworzy mikroprzestrzeń, która oddziela neurony o różnej gęstości.
Kultura o dużej gęstości działa jak warstwa zasilająca i wydziela neuronalny czynnik wzrostu.
Ze względu na ograniczoną przestrzeń dyfuzyjną czynniki wzrostu gromadzą się wokół neuronów, ułatwiając ich wzrost i rozwój projekcji neuronalnych.
Wprowadź pożywkę neurobazalną z arabinozydem cytozyny, który selektywnie hamuje wzrost komórek nieneuronalnych.
Regularnie uzupełniaj świeżą pożywką neuropodstawną, aby utrzymać kulturę neuronalną.
W tej procedurze umieść 24-dołkowe płytki z wytrawionym dnem dla neuronów o dużej gęstości w kapturze hodowlanym. Usunąć 300 mikrolitrów wstępnie kondycjonowanego podłoża za pomocą próżni. Następnie umieść 0,6 mililitra zawiesiny komórek o dużej gęstości w ilości 250 000 neuronów na mililitr.
Pozostałe 224-dołkowe płytki ze szkiełkami nakrywkowymi umieścić w kapturze hodowlanym. Usuń 300 mikrolitrów wstępnie kondycjonowanego podłoża za pomocą próżni, a następnie posiew 0,6 mililitra zawiesiny komórek o niskiej gęstości przy 10 000 neuronów na mililitr na szkiełkach nakrywkowych. Następnie należy umieścić wszystkie płytki 24-dołkowe z powrotem w inkubatorze i inkubować przez dwie godziny. Następnie odwróć szkiełka nakrywkowe o niskiej gęstości z przylegającymi neuronami do kultury o dużej gęstości i upewnij się, że neurony są zwrócone do siebie. Następnie zwróć dwie płytki z kokulturą do inkubatora.
Nakarm kokultury, dodając 300 mikrolitrów świeżej pożywki paszowej w DIV 5. Po tym wstępnym karmieniu co tydzień dodawaj 300 mikrolitrów świeżej pożywki paszowej bez arabinozydu cytozyny do każdej studzienki. Jeśli kultura jest przechowywana dłużej niż jeden miesiąc, co tydzień zastępuj połowę pożywki świeżą pożywką, po upływie jednego miesiąca.