Inicjowanie szybkiej rozbudowy neurytów i tworzenie funkcjonalnych połączeń neuronalnych

Zacznij od zmontowania urządzenia mikroprzepływowego zawierającego mikrokanaliki w naczyniu pokrytym lizyną.

Zasiej neurony embrionalne pożywką wzrostową do studzienek mikroprzepływowych, umożliwiając im przepływ przez mikrokanały.

Inkubuj, aby ułatwić przyczepianie się i wzrost neuronów, tworząc fizycznie izolowane populacje neuronów.

Zdemontuj zestaw i umieść naczynie w komorze mikromanipulatora z przepływem soli fizjologicznej, aby utrzymać żywotność komórek.

Wprowadź kulki pokryte lizyną w pobliżu neuronów, umożliwiając neurytom lub projekcjom komórkowym przyczepianie się i tworzenie kompleksów koralik-neuryt.

Za pomocą mikromanipulatora zastosuj ssanie, aby włączyć kompleks koralikowo-neurytowy z jednego kanału.

Pociągnij ten kompleks, aby wywołać napięcie mechaniczne, co prowadzi do szybkiego wydłużenia neurytów.

Poprowadź to w kierunku innego kompleksu koralik-neuron i przytrzymaj go za pomocą drugiego mikromanipulatora.

Utrzymuj oba koraliki na miejscu, aby ułatwić tworzenie połączenia neurytycznego.

Zwolnij ssanie i zastąp sól fizjologiczną pożywką hodowlaną.

Inkubacja w celu ustanowienia funkcjonalnych połączeń między neuronami, promując komunikację za pośrednictwem neuroprzekaźników.

Usunąć pożywkę z górnych studzienek urządzeń mikroprzepływowych bez opróżniania studzienek. Następnie dodaj 20 mikrolitrów stężonego roztworu komórkowego do prawego górnego dołka urządzenia mikroprzepływowego i sprawdź w mikroskopie, jak komórki przepływają wewnątrz urządzenia mikroprzepływowego z pojedynczą populacją.

Aby umieścić komórki w urządzeniu dla wielu populacji, dodaj 20 mikrolitrów stężonego roztworu komórkowego do każdej z górnych studzienek. Pod mikroskopem sprawdź, czy komórki znajdują się w komorach. Następnie umieść urządzenia w inkubatorze na 15 do 30 minut, aby ułatwić przyczepienie komórek do podłoża.

Po przyczepieniu się komórek do podłoża dodaj 40 mikrolitrów NBM do dwóch górnych studzienek pojedynczego urządzenia populacyjnego. Pomoże to usunąć pęcherzyki powietrza z mikrokanałów. Dodaj 20 mikrolitrów NBM do górnych studzienek urządzenia do wielu populacji, tych samych studzienek, w których wstrzyknięto komórki. Pożywka powinna lekko wystawać, tworząc dodatni menisk i nadawać studzienkom wygląd muffinki.

Na jeden do dwóch dni przed usunięciem urządzeń mikroprzepływowych dodaj 2 mililitry wstępnie podgrzanego NBM do każdej naczynia na próbkę i zalej komory. Następnie trzymaj urządzenia w inkubatorze. Następnie użyj sterylnej pęsety i końcówki pipety, aby usunąć urządzenia mikroprzepływowe z szkiełek nakrywkowych, pozostawiając wzorzystą konfigurację neuronów.

W tej procedurze dodaj 40 do 60 mikrolitrów przygotowanych kulek pokrytych PDL do hodowli komórkowej. Następnie zwróć próbkę do inkubatora na jedną godzinę, aby przyspieszyć tworzenie kontaktów synaptycznych. Następnie zainstaluj próbkę w konfiguracji eksperymentalnej, tak aby komórki mogły być oceniane od góry za pomocą dwóch mikropipet, a także miały dostęp optyczny. W tej konfiguracji kamera CCD znajduje się w bocznym porcie mikroskopu w celu przechwytywania obrazu. Podłącz każdą pipetę wypełnioną solą fizjologiczną do 1-mililitrowej strzykawki. Następnie należy przetopić próbkę roztworem soli fizjologicznej.

Następnie pod mikroskopem sprawdź przerwę między dwiema izolowanymi populacjami neuronów, aby upewnić się, że te dwie populacje nie są naturalnie połączone. Wybierz koralik PDL, który nie jest przyczepiony do neuronu w polu view. Wyrównaj koralik z końcówką mikropipety, skupiając się na kulce, a następnie na mikropipecie.

Następnie przyłóż końcówkę jak najbliżej ściegu, monitorując ją przez mikroskop. Następnie zastosuj podciśnienie do pipety, aby podnieść koralik i utrzymuj podciśnienie przez cały czas trwania eksperymentu.

Teraz wybierz koralik PDL przyczepiony do neuronu w polu widzenia i podłącz go do drugiej mikropipety za pomocą odsysania. Pociągnij kompleks koralik-neuron PDL, powoli przesuwając mikromanipulator lub stolik próbki z prędkością 0,5 mikrometra na minutę przez 1 mikrometr i zatrzymaj się na pięć minut, aby umożliwić inicjację neurytu.

Pociągnij kompleks koraliko-neuron PDL, powoli przesuwając go na boki z prędkością 0,5 mikrometra na minutę przez 2 mikrometry. Następnie zatrzymaj się na pięć minut, aby umożliwić wydłużenie neurytów. Po udanej inicjacji i rozciągnięciu neurytu przez pierwsze 5 mikrometrów, stale ciągnij neuryt z prędkością 20 mikrometrów na minutę.

Aby połączyć neurony, wybierz region bogaty w neuryty. Użyj innych kulek, aby ocenić wysokość końcówki pipety nad szkiełkiem nakrywkowym i opuść kompleks PDL kulka-neuryt tak, aby fizycznie stykał się z neurytami. Pozostawić kompleks PDL kulka-neuryt w kontakcie z docelowym neurytem podczas manipulowania drugą mikropipetą. Następnie opuść drugą pipetę z drugą kulką PDL na nowo utworzony neuryt około 20 mikrometrów od pierwszego koralika i użyj drugiej kulki PDL, aby popchnąć nowy filament neurytu w kierunku komórki docelowej.

Następnie przytrzymaj oba koraliki na miejscu przez co najmniej godzinę. Sprawdź, czy nie ma obrzęku ogniskowego, pogrubienia neurytów stykających się ze koralikiem z mikroskopem. W tym czasie powoli zmieniaj pożywkę próbki z soli fizjologicznej na wstępnie podgrzany NBM zrównoważony dwutlenkiem węgla.

Zwolnij koralik z drugiej pipety, zwalniając ssanie. Jeśli nowy neuryt pozostaje przyczepiony, zwolnij również pierwszą prędkość. Następnie ostrożnie umieść próbkę z powrotem w inkubatorze, aby wzmocnić połączenie neuronalne do przyszłych eksperymentów.