Strategie przeszczepu komórek macierzystych w celu przywrócenia dysfunkcji poznawczych spowodowanych radioterapią czaszki

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest powtarzalne przeszczepienie komórek macierzystych do hipokampa. Po pierwsze, szczury atymiczne są poddawane radioterapii stereotaktycznej, symulującej to, co może się zdarzyć podczas klinicznego leczenia raka mózgu. W laboratorium ludzkie nerwowe komórki macierzyste są hodowane do przeszczepu, zwykle do leczenia pojedynczego szczura potrzeba 1 miliona komórek.

Dwa dni po napromienianiu komórki macierzyste są powoli wstrzykiwane do hipokampa w ściśle określonym miejscu. Ostatecznie protokół pokazuje migrację przeszczepionych komórek macierzystych w całym hipokampie. Po raz pierwszy wpadłem na pomysł tych metodologii, kiedy zacząłem rozważać perspektywy wykorzystania komórek macierzystych do odwrócenia hamowania neurogenezy Po napromienianiu czaszki, Ogólnie rzecz biorąc, osoby znane z tej metody będą walczyć, ponieważ wzrost komórek macierzystych nie jest trywialny i wymaga codziennej uwagi i opieki w warunkach wzrostu wolnego od antybiotyków.

Wizualna demonstracja tej procedury zdemistyfikuje proces kliniczny stosowany do rekonstrukcji obrazów w celu precyzyjnego napromieniania małych, dobrze zdefiniowanych objętości mózgu. Procedurę napromieniania zademonstruje dr Dante Rowa, profesor kliniczny z mojego wydziału. Przygotowanie komórek macierzystych zostanie zademonstrowane przez techników Mary Land i Catherine Tran w moim laboratorium, a dr Muja, doktor habilitowany, zademonstruje procedury wymagane do przeszczepu.

Wykorzystujemy oprogramowanie do radioterapii sterowanej obrazem do dokładnego pozycjonowania zwierząt przed leczeniem oraz modulowaną radioterapię do celowanego napromieniania przy minimalnym uszkodzeniu innych części mózgu przez promieniowanie. 24 godziny po skanowaniu MRI wygeneruj kolejną objętość obrazu przekrojowego, umieszczając uspokojone zwierzę w tomografie komputerowym do radioterapii onkologicznej. Umieść szczura w tej samej pozycji, która jest używana do skanowania MRI i ustaw tomografię komputerową tak, aby skanowała obszar czaszki w celu wygenerowania danych dotyczących planowania leczenia TK.

Uzyskaj 106 obrazów CT o grubości obrazu 0,8 milimetra. Następnie prześlij dane z obrazu MRI i CT do oprogramowania do planowania leczenia Eclipse. Użyj zaćmienia, aby połączyć dane MRI i CT w oparciu o anatomię kości i dopasowanie tkanek miękkich.

Jest to krok zmienny w czasie i w zależności od jakości obrazu proces ten może trwać od jednej do trzech godzin. Po uzyskaniu zadowalającej fuzji obrazu należy obrysować obszary docelowe, które mają być napromieniowane, a także sąsiednie narządy krytyczne. Napromienianie może być dostarczane do całego mózgu lub ograniczone do określonych obszarów wolumetrycznych, takich jak poszczególne kampy hipopotamów.

Kontury dostarczają nie tylko informacji o lokalizacji tych narządów, ale także informacji o objętości, które będą miały kluczowe znaczenie dla dostosowania rozkładu dawki. Aby dostosować rozkład dawek. Wprowadź informacje o dawce docelowej, zgodności docelowej i ograniczeniach dawki dla krytycznych narządów do okna optymalizacji dawki w eclipse.

Po wygenerowaniu planu, eclipse dostarcza obliczoną dawkę nałożoną na osiowe obrazy koronalne i strzałkowe, a także w formacie histogramu objętości dawki. To właśnie w tym momencie plan musi zostać oceniony, aby określić, czy nadaje się do realizacji, czy też wymaga poprawy. Aby rozpocząć proces napromieniania, umieść uspokojonego szczura pod papierowym kocem, aby go ogrzać.

Po kilku minutach umieść szczura na stole zabiegowym liniowego akceleratora radioterapii przykrytym kocem, ale z odsłoniętą czaszką. Pamiętaj, aby umieścić go w tej samej pozycji, w której został użyty do wygenerowania tomografii komputerowej. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia dokładności podawania dawki.

Następnie należy uzyskać ortogonalne obrazy rentgenowskie szczurów w sedacji za pomocą pokładowego systemu obrazowania w akceleratorze liniowym radioterapii, które współrejestrują ortogonalne obrazy rentgenowskie z zestawem obrazów referencyjnych dostarczonym przez Eclipse i przystępują do stosowania niezbędnych korekt położenia w celu prawidłowego wyrównania obrazu. Dostarczyć napromieniowanie w postaci dawki 10 stopni z sześciopolowym planem IMRT dla pojedynczego hipokampa i z planem szybkiego łuku z dwoma łukami dla obu napromienień Hippo campi. Po zakończeniu leczenia zdejmij folię z sali zabiegowej i pozwól jej dojść do siebie w ogrzewanej klatce.

Aby przygotować się do operacji, użyj elektrycznych maszynek do strzyżenia, aby usunąć sierść z głowy znieczulonego szczura A TN. Oczyść ogolony obszar wielokrotnymi aplikacjami jodu powidonu i 70% etanolu działającego w okapie z przepływem laminarnym. Przygotuj instrumenty stereotaktyczne, wiertło mikromolowe, sterylizator ze złożem suchym i kontrolery.

Utrzymuj zwierzę w cieple podczas operacji, umieszczając je na rozgrzanej powierzchni. Sterylne rękawiczki są noszone przed i w trakcie operacji i spryskane 70% etanolem. Sprzęt chirurgiczny jest utrzymywany w dedykowanym kapturze z przepływem laminarnym.

Aby zachować warunki aseptyki, przykryj zwierzę małą serwetą chirurgiczną, tak aby odsłonięta była tylko głowa. Ustaw głowę zwierzęcia mocno w ramie stereotaktycznej, wkładając nauszniki do zewnętrznego słuchu atu. Zachowaj szczególną ostrożność podczas wsuwania końcówki listwy powietrznej do kanału słuchowego.

Umieść siekacz, zaczepiając górne siekacze szczura i dostosowując wysokość pręta do standardowego punktu odniesienia. Następnie dokręć zacisk nosowy. Wyśrodkuj pozycję głowy między nausznikami przy minimalnym ruchu bocznym, aby osiągnąć stereotaktyczne zero.

Po ustawieniu zwierzęcia na miejscu nałóż smarującą maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu. Nałożyć maść jeszcze raz podczas zabiegu. Za pomocą sterylnego skalpela wykonaj dwucentymetrowe nacięcie skóry w linii środkowej wzdłuż skóry głowy.

Oczyść obszar za pomocą sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką. Następnie włóż zwijacz preparacyjny, aby utrzymać otwartą okostną. Mocno uciskaj obszar, jeśli wystąpi krwawienie.

Za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką zamoczonego w 1% nadtlenku wodoru usuń tkanki miękkie pokrywające czaszkę, aż widoczne będą szwy bgma i lambda. Najtrudniejszym aspektem chirurgii stereotaktycznej jest precyzyjne ułożenie głowy zwierzęcia w stereotaktycznym kadrze. Aby oznaczyć dokładne współrzędne stereotaktyczne na czaszce zwierzęcia, użyj atlasu mózgu do owijania, aby określić dokładne współrzędne stereotaktyczne przy użyciu B bgma jako odniesienia W tym badaniu przeszczep komórek macierzystych odbywa się w czterech różnych miejscach przy użyciu następujących współrzędnych stereotaktycznych do oznaczenia lokalizacji na czaszce, najpierw zidentyfikuj bgma.

Następne zero. Wszystkie trzy współrzędne na cyfrowym kontrolerze wyświetlacza. Po wyzerowaniu użyj wcześniej ustalonych współrzędnych, aby zlokalizować miejsca przeszczepu i zrobić znak za pomocą cienkiego znacznika punktowego przymocowanego do uchwytu sondy na ramie.

Użyj wiertła, aby zrobić 0,35 milimetra otwory w czaszce w każdym zaznaczonym miejscu. Uważaj, aby nie dopuścić do uszkodzenia membrany Durham. Jeśli podczas wiercenia wystąpi krwawienie, mocno dociśnij za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką.

Zwierzę jest teraz gotowe do przeszczepu. Ludzkie nerwowe komórki macierzyste wykorzystywane do przeszczepu powinny być przygotowane z wyprzedzeniem i przechowywane na lodzie do czasu, gdy będą potrzebne. Gdy będziesz gotowy, napełnij mikrostrzykawkę Hamiltona o rozmiarze 5 mikrolitrów i rozmiarze 30 z zawiesiną komórek.

Przymocuj napełnioną strzykawkę do małego uchwytu sondy na ramie stereotaktycznej. Po ustawieniu we właściwej pozycji ostrożnie włóż końcówkę igły do otworu w czaszce, aż dotrze do powierzchni mózgu. Wyzeruj współrzędną DV na cyfrowym kontrolerze wyświetlacza, a następnie delikatnie włóż igłę na żądaną głębokość.

Trzymaj igłę na miejscu przez jedną minutę. Po tym czasie wstrzyknij komórki w ilości 0,25 mikrolitra na minutę, co daje w sumie jeden mikrolitr. Trzymaj igłę na miejscu przez osiem minut przed wycofaniem, aby zapobiec cofaniu się treści wstrzykniętej z powrotem przez tor igły, powoli wycofuj igłę z miejsca przeszczepu z szybkością 0,5 milimetra na minutę.

Powtórz tę procedurę dla pozostałych miejsc przeszczepu. Po zakończeniu wstrzyknięć wyjmij retraktor skóry i użyj pęsety, aby delikatnie naciągnąć skórę z powrotem na czaszkę. Zamknij ranę za pomocą czterech do pięciu sterylnych klipsów ze stali nierdzewnej po zabiegu.

Umieść zwierzę w ogrzewanej klatce i monitoruj jego powrót do zdrowia. Miesiąc po przeszczepie próbki mózgu zostały pocięte na sekcje i wybarwione BRDU w celu wykrycia przeszczepionego NSCS i przeciwdziałania barwieniu hematyną. Ścieżka igły reprezentowana tutaj przez czerwoną linię wskazuje trajektorię wstrzyknięcia, która zdeponowała NSCS w miejscu uwolnienia przeszczepu oznaczonym jako TR, jak widać.

W tym przypadku przeszczepione NSCS wykazały rozległą migrację z regionów corpus cossum i CA one do zakrętu dente i około trzech regionów hipokampa. Ważne jest, aby zestaw obrazów do pozyskania Mr.I był używany dokładnie do odpowiadającego mu zestawu obrazów CT. Właściwa fuzja obrazu ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji, a następnie konturowania obszarów hipokampa przed zabiegiem leczenia, uzyskaj lub ortogonalne obrazy rentgenowskie, aby zapewnić dokładne ustawienie zwierzęcia Aby zapewnić powodzenie przeszczepu, utrzymuje sterylne środowisko chirurgiczne przez cały czas.

Oznacz Otax precyzyjnie koordynuje i stopniowo wyjmuje mikrostrzykawkę po wstrzyknięciu, aby zapobiec refluksowi płynu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić klinicznie istotną procedurę naświetlania przy użyciu wybranego przez siebie modelu zwierzęcego i jak chirurgicznie przeszczepić komórki macierzyste do precyzyjnego obszaru mózgu.