Izolowanie i hodowla komórek z rozlanego glejaka wewnętrznego mostu

Zacznij od fragmentów tkanki pnia mózgu zawierających rozlanego glejaka mostu, guz pochodzący z glejowych komórek progenitorowych w zmielinizowanym środowisku bogatym w nerwy.

Traktuj enzymami proteolitycznymi, aby zdegradować macierz zewnątrzkomórkową tkanki.

Po inkubacji należy kilkakrotnie pipetować zawartość, aby ułatwić dysocjację komórek i degradację osłonki mielinowej.

Przefiltruj i odwiruj, aby zebrać komórki. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić je w zimnym buforze.

Dodaj roztwór sacharozy w celu separacji gradientu gęstości i dokładnie wymieszaj.

Następnie odwirować, aby oddzielić cięższe komórki od lżejszych resztek mieliny.

Usuń warstwę mieliny i dodaj bufor do lizy RBC.

Dodaj zimny bufor, aby zatrzymać działanie lizy. Odwirować i usunąć supernatant, aby wyeliminować zlizowane erytrocyty.

Zawiesić komórki w ciepłym podłożu neurobazalnym i hodować je w kolbie bez powłoki.

Brak czynników neurotropowych powoduje śmierć neuronów, podczas gdy komórki progenitorowe gleju wykorzystują składniki odżywcze i czynniki wzrostu, co prowadzi do proliferacji. Dodaj świeżą pożywkę, aby utrzymać poziom czynnika wzrostu.

Z biegiem czasu komórki te spontanicznie agregują się w klastry komórkowe, tworząc swobodnie unoszące się neurosfery.

W tej procedurze należy odwirować stożkową probówkę zawierającą pozostałe fragmenty tkanki przez pięć minut. Następnie usuń supernatant i dodaj wstępnie podgrzany roztwór do trawienia enzymatycznego tak, aby na każdy 1 mililitr tkanki przypadało 5 mililitrów roztworu trawiącego. Następnie uszczelnij stożkową pokrywę probówki folią laboratoryjną i inkubuj reakcję na rotatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Po inkubacji próbki należy delikatnie rozcierać. Za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej należy pipetować próbkę w górę i w dół od 6 do 8 razy i unikać wytwarzania nadmiernych pęcherzyków powietrza. Następnie dodaj końcówkę pipety o pojemności 1000 mikrolitrów na koniec pipety i rozcieraj próbkę przez dodatkowe 6 do 8 razy.

Pozwól, aby pozostałe kawałki osiadły na dnie tuby. Następnie wyjmij i przefiltruj supernatant z komórką nadal zawieszoną przez filtr 100 mikronów do nowej 50-mililitrowej stożkowej rurki z oznaczeniem dysocjacji enzymatycznej i przechowuj ją na lodzie. Następnie odwiruj enzymatyczną probówkę dysocjacyjną przez pięć minut i kontynuuj wirowanie w gradiencie sacharozy. Jeśli próbka jest nadal zawieszona w roztworze, odwirować ją przez pięć minut.

Następnie usuń supernatant i ponownie zawieś tkankę w 20 mililitrach zimnego HBSS bez wapnia i magnezu. Następnie zwiększ objętość do 25 mililitrów zimnym HBSS. Powoli dodaj 25 mililitrów 1,8-molowego roztworu sacharozy i odwróć probówkę, aby wymieszać. Daje to gradient sacharozy 0,9 molowej.

Następnie odwirować próbkę bez przerwy przez 10 minut. Ostrożnie odessać resztki mieliny i jak najwięcej roztworu sacharozy. Następnie umyj próbkę, dodając 30 mililitrów zimnego HBSS bez wapnia i magnezu i delikatnie mieszając. Następnie odwiruj go przez pięć minut.

W tej procedurze usuń supernatant do mycia. Dodaj 5 mililitrów buforu do lizy ACK i delikatnie ponownie zawieś osad komórkowy, obracając probówkę przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Następnie ugasić lizę, dodając 30 mililitrów zimnego HBSS bez wapnia i magnezu.

Następnie odwiruj go przez pięć minut. Ponownie zawiesić końcową osadkę komórkową w 10 do 15 mililitrach ciepłego kompletnego TSM z czynnikami wzrostu i określić ilościowo gęstość żywotnych komórek na hemocytometrze za pomocą wykluczenia błękitu trypanowego. Następnie przenieść ostatnią zawiesinę komórek do nowej kolby hodowlanej T75. Dodawaj dodatkowe czynniki wzrostu co drugi dzień, aby utrzymać ogólny poziom czynnika wzrostu i monitorować rozwój neurosfer komórek nowotworowych.