Izolowanie fluorescencyjnie znakowanych neuronów z mysiego mózgu

Weźmy transgeniczną korę myszy zawierającą neurony wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych.

Zamocuj go na uchwycie na próbkę.

Zamontuj uchwyt na tacce wibratomu zawierającej natleniony aCSF, aby utrzymać warunki fizjologiczne tkanki.

Korzystając z ustawionych parametrów, uzyskaj wycinki koronalne.

Umieść plastry w siatkowym uchwycie zawierającym natleniony aCSF i blokery aktywności, aby je ustabilizować.

Potraktuj plastry proteazami, aby strawić macierz zewnątrzkomórkową i rozluźnić komórki.

Przemyć płynem mózgowo-rdzeniowym, aby usunąć proteazy.

Przenieś plastry na płytkę hodowlaną z CSF i surowicą.

Pod mikroskopem fluorescencyjnym wypreparuj obszary plasterków zawierające neurony fluorescencyjne.

Przenieść wypreparowane fragmenty do probówki zawierającej płyn mózgowo-rdzeniowy i surowicę.

Mechanicznie dysocjuj tkankę, tworząc zawiesinę jednokomórkową. Przenieść komórki na płytkę hodowlaną zawierającą płyn mózgowo-rdzeniowy.

Pod mikroskopem fluorescencyjnym użyj pipety kapilarnej, aby zebrać fluorescencyjne neurony.

Dozuj te neurony do płytki hodowlanej zawierającej CSF w celu dalszej analizy.

Wypreparuj mózg myszy poddanej eutanazji, otwierając czaszkę małymi nożyczkami i wydobywając świeży mózg za pomocą cienkich kleszczy bez uszkadzania kory. Umieść mózg w schłodzonym i natlenionym płynie mózgowym, pozostawiając kamień napowietrzający przyłączony do 5% tlenu o równowadze dwutlenku węgla przez cały czas trwania sekcji.

Umieść mózg na uchwycie wibratorowym i wytnij odcinki koronalne lub strzałkowe o grubości 300 mikronów. Zbierz tyle sekcji, ile potrzeba, aby uzyskać co najmniej od 10 do 50 oznaczonych komórek. Połóż plastry na uchwycie na plastry o siatkach bawełny umieszczonym w zlewce, tak aby były skąpane w natlenionym CSF.

Przenieś plastry do zlewki zawierającej CSF z blokerami aktywności i blokuj przez 15 do 20 minut w temperaturze pokojowej, bulgocząc tlenem za pomocą kamienia napowietrzającego. Przenieś plastry do zlewki zawierającej CSF z roztworem proteazy, aby przeprowadzić łagodne trawienie w temperaturze pokojowej. Po roztrawieniu wypłukać proteazę, przesuwając plastry z powrotem do zlewki zawierającej CSF z roztworem blokującym aktywność przez 5 do 10 minut w temperaturze pokojowej. Kontynuuj bulgoczący tlen.

Następnie należy przygotować 100-milimetrową szalkę Petriego zawierającą aCSF z 1% FBS w temperaturze pokojowej i przenieść poszczególne sekcje do naczynia w celu mikrodysekcji. Pod fluorescencyjnym lunetą preparacyjną użyj pary cienkich kleszczy do mikropreparowania obszarów i warstw zainteresowania mających co najmniej 10 do 50 komórek.

Za pomocą pipety Pasteura przenieś wypreparowane kawałki do 2-mililitrowej probówki mikrowirówkowej zawierającej około 0,8 mililitra 1% FBS w roztworze CSF. Rozwarstwioną tkankę należy rozwarstwić w probówce do mikrofugi w temperaturze pokojowej.

Wykonaj około 10 pociągnięć każdą z płomieniowanych pipet Pasteura, zaczynając od największej, a kończąc na najmniejszej średnicy wylotu. Dozuj zdysocjowane komórki do 100-mililitrowej szalki Petriego zawierającej natleniony aCSF i odczekaj 5 do 7 minut, aż komórki stopniowo się uspokoją.

Obserwuj sygnał GFP i RFP pod mikroskopem preparacyjnym. Zidentyfikuj szczątki, badając morfologię w świetle jasnego pola. Po zidentyfikowaniu obszaru komórek z niewielką ilością zanieczyszczeń, użyj kapilary i dołączonej rurki, aby pobrać komórki, blokując koniec zaworu rurki językiem. Następnie umieść kapilarnę blisko komórek. Zwolnij blok na kapilarze i szybko zablokuj ponownie, aby uchwycić komórkę za pomocą działania kapilarnego.

Przenieś kapilarnę na 100-milimetrową szalkę Petriego ze świeżo natlenionym aCSF i delikatnie dmuchnij do probówki, obserwując końcówkę kapilary pod optyką fluorescencyjną, aby dozować komórki do naczynia. Powtarzaj procedurę zbierania, aż do pobrania od 100 do 150 komórek, upewniając się, że zanieczyszczenia, takie jak zanieczyszczenia, są minimalne w kontrastowych optykach interferencyjnych w jasnym polu.