Transfekcja i nukleofekcja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest uzyskanie wysokiej wydajności transfekcji w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych poprzez zastosowanie zoptymalizowanych protokołów transfekcji i nukleofekcji. Cel ten realizowany jest poprzez uprzednie ustanowienie kultur ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych bez udziału komórek feeder. Do transfekcji ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste wysiewa się na gelt, TRX lub matrigel na noc.

Podczas transfekcji jądrowej, za pomocą trypsyny uzyskuje się małe skupiska komórek, po czym do wysianych komórek dodaje się mieszaninę plazmidowego DNA i odczynnika do transfekcji genów, a następnie płytkę wiruje i inkubuje w temperaturze 37°C. Zawiesinę ludzkich komórek iPS poddaje się transfekcji jądrowej w urządzeniu do transfekcji jądrowej, a komórki resuspenduje się w medium kondycjonowanym i inkubuje w temperaturze 37°C. Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące efektywną manipulację genetyczną dzięki wysokiej wydajności transfekcji w ludzkich komórkach iPS.

Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak wcześniej opisana elektroporacja do transfekcji oraz metody transfekcji jądrowej, jest możliwość rutynowego osiągania wysokiej wydajności transfekcji w ludzkich komórkach iPS przy zachowaniu spójnych wyników w naszym laboratorium. Nasze protokoły zapewniają również minimalną śmiertelność komórek po modyfikacji genetycznej. W związku z tym nasze protokoły umożliwiają szybkie i wielkoskalowe generowanie transgenicznych linii ludzkich komórek iPS. Przed adaptacją ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do kultur bez fibroblastów (feeder-free), należy przygotować naczynia pokryte Geltrex.

Następnie, ludzkie IPCs wcześniej hodowane na komórkach karmicielkach przemyj 1 ml Accutane na studzienkę i inkubuj w temperaturze 37 °C przez jedną minutę, aż większość komórek zacznie się odrywać; dodaj do komórek od 10 do 15 szklanych kulek i delikatnie potrząśnij płytką. Następnie dodaj 2 ml KnockOut DMEM/F12 i delikatnie potraktuj pipetą. Przenieś zawiesinę komórkową do probówki wirówki o pojemności 10 ml.

Wiruj komórki z prędkością 800 RPM przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Odessaj nadsącz, pozostawiając nienaruszony pellet ludzkich iPSC. Delikatnie stuknij probówkę, aby łagodnie rozbić pellet komórkowy.

Reese, zawieś osad ludzkich iPSC w odpowiedniej objętości pożywki STEM pro i rozdziel go pomiędzy dołki płytki powlekanej TRE gel. W zależności od szybkości proliferacji, ludzkie iPC można pasażować w stosunku rozdzielenia od 1:2 do 1:6. Ostrożnie umieść płytkę w inkubatorze z 5% carbon dioxide w temperaturze 37 degrees Celsius i delikatnie zakręć płytką, aby zapewnić równomierny rozkład komórek w dołkach.

Dokarmiaj komórki codziennie. Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, są gotowe do ponownego pasażowania na nowy żel. W dniu transfekcji, aby uzyskać optymalną wydajność transfekcji, komórki w studziach powlekanych Rex przy stosunku podziału jeden do dwóch powinny osiągnąć około 40 do 50% konfluencji i tworzyć małe kolonie równomiernie rozmieszczone na powlekanym żelu w studziach.

Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj 100 µL pożywki do knockoutu w sterylnym probówce typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml. Dodaj 27 µL odczynnika do transfekcji gene juice, wymieszaj dokładnie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie dodaj 4 µg plazmidowego DNA.

Wybór plazmidu ma kluczowe znaczenie dla optymalnej wydajności transfekcji. Plazmid zastosowany w tej procedurze zawiera wzmocnione zielone białko fluorescencyjne pod kontrolą promotora CAG, który jest silnym promotorem aktywnym transkrypcyjnie w ludzkich IPC. Inkubuj probówkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut.

Po 15 minutach dodać mieszaninę DNA (gene juice) do komórek i zakryć płytkę. Wirować płytkę z prędkością 1 200 RPM przez pięć minut, aby zwiększyć kontakt mieszaniny do transfekcji z ludzkimi komórkami IPC w dołku. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez noc, aż do następnego dnia.

Monitoruj wydajność transfekcji w dniu nukleofekcji; poddaj ludzkie iPSC wstępnej obróbce z użyciem 10 µM inhibitora ROCK przez co najmniej jedną godzinę w temperaturze 37 °C. W czasie wstępnej obróbki ludzkich iPSC przygotuj 82 µL roztworu do nukleofekcji komórek macierzystych człowieka w sterylnym probówce typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml. Dodaj 80 µL.

Uzupełnić i dokładnie wymieszać poprzez pipetowanie. Inkubować roztwór w temperaturze 37°C przez pięć minut. Poddygestorem podgrzać do 37°C wcześniej przygotowaną pożywkę warunkowaną komórkami feeder oraz 0,25% trypsyny w EDTA.

Należy opisać jedną sterylną probówkę stożkową o pojemności 15 ml. Ostrożnie usunąć medium z hodowli ludzkich iPSC przeznaczonych do transferu jąder, a następnie delikatnie przemyć komórki solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS). Odessać PBS i dodać trypsynę, po czym inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez trzy minuty.

Dla pomyślnej nuklefekcji krytyczne jest, aby nie trypsynizować komórek do stanu pojedynczych komórek. Zamiast tego komórki należy utrurować do postaci małych skupisk składających się z dwóch do trzech komórek. Delikatnie resuspenderuj komórki za pomocą końcówki pipety P 1000, tworząc małe skupiska składające się z dwóch do trzech komórek.

Wypłucz dno dołka, wielokrotnie pipetując zawartość, aby upewnić się, że wszystkie ludzkie IPC zostały całkowicie ododerwane. Następnie przenieś zawiesinę komórkową do oznakowanej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Następnie dodaj dziewięć mililitrów pożywki dla zarodkowych fibroblastów myszych.

Aby dezaktywować trypsynę, wiruj komórki z prędkością 800 RPM przez trzy minuty. Ostrożnie odessij nadsącz, pozostawiając nienaruszony pellet komórkowy. Resuspenderuj komórki w 100 µL podgrzanej wcześniej roztworu efektora jądrowego ludzkich komórek macierzystych.

Używając końcówki do pipety o objętości 1 ml, przenieś komórki do probówki do transfekcji jądrowej. Do zawiesiny komórkowej w probówce dodaj 4 µg plazmidowego DNA, a następnie wymieszaj komórki z DNA poprzez delikatne kręcenie probówką. Dwukrotnie stuknij probówkę o powierzchnię dygestorium.

Włóż probówkę do uchwytu efektora jądrowego w urządzeniu do elektroporacji. Wybierz program B 0 1 6 dla komórek poddawanych elektroporacji, naciskając przycisk x; wyświetli się komunikat Okay. Po zakończeniu procesu elektroporacji, który zazwyczaj trwa od jednej do pięciu sekund, użyj dołączonej do zestawu plastikowej pipety pasterowskiej, aby pobrać elektroporowane komórki z probówki. Odzyskaj komórki, resuspendując je w uprzednio ogrzanym medium CM z inhibitorem ROCK w sterylnym probówce typu eppendorf o pojemności 1,5 ml. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez 10 minut.

Po 10 minutach za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 ml przenieść komórki kroplami na warstwy komórek karmicieli. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez noc, a następnie przez kolejny dzień. Monitorować wydajność transfekcji.

Przedstawione tutaj mikrofotografie obrazują ludzkie komórki iPSC linii RIV wykazujące ekspresję EGFP, które zostały transfektowane za pomocą GeneJuice na żelu Rex 12 godzin po transfekcji plazmidem. Transfekcja DNA ludzkich komórek iPSC przy użyciu GeneJuice z silnym promotorem zazwyczaj pozwala uzyskać ponad 60% komórek wykazujących ekspresję reportera EGFP w teście transfekcji przejściowej.

Komórki wykazujące ekspresję EGFP można również uzyskać poprzez nukleofekcję, co zilustrowano na obrazach ludzkich komórek iPSC RIV one, wysianych i uformowanych na komórkach feeder po nukleofekcji z zastosowaniem programu nukleofekcji B 0 1 6 lub programu A 0 2 3. Zastosowanie programu B 0 1 6 skutkuje uzyskaniem do 80% komórek pozytywnych pod kątem EGFP, podczas gdy program A 0 2 3 dał mniej niż 10% komórek pozytywnych pod kątem EGFP. Ponadto możliwe jest wyizolowanie stabilnych klonów transgenicznych ludzkich komórek iPSC wykazujących ekspresję genu trends.

Poniżej przedstawiono przykład stabilnie ekspresyjnych kolonii ludzkich iPSC z powszechną ekspresją EGFP pochodzącą z gene juice. Komórki te zachowują konstytutywną ekspresję EGFP podczas różnicowania w ciała zarodkowe. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić nuklefekcję i transfekcję ludzkich komórek iPS.

Efektywna manipulacja genetyczna jest niezbędnym narzędziem do badania różnych aspektów biologii komórek macierzystych i przyspieszy wykorzystanie ludzkich linii komórek iPS w medycynie regeneracyjnej.