Name: Transfekcja i nukleofekcja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Poznaj zoptymalizowane protokoły transfekcji i nukleofekcji ludzkich komórek iPSC, które zapewniają wysoką wydajność przy minimalnej śmierci komórek. Metody te umożliwiają generowanie linii transgenicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace opisane w niniejszym manuskrypcie były możliwe dzięki finansowaniu z California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) dla UCR Stem Cell Core.

Nasz protokół rozpoczyna się od metody adaptacji ludzkich iPSC do kultur bez fibroblastów (feeder-free), a następnie obejmuje procedury transfekcji ludzkich iPSC przy użyciu GeneJuice (EMD) oraz nukleofekcji ludzkich iPSC z wykorzystaniem urządzenia AMAXA nuclefector.
Uwaga: Poniższe procedury są wykonywane w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza. Wszystkie pożywki i roztwory są równoważone do 37°C lub temperatury pokojowej przed rozpoczęciem prac, chyba że zaznaczono inaczej.
1. Ustanawianie ludzkich iPSC w systemie bez komórek karmnych
Ludzkie iPSC, uprzednio hodowane na komórkach karmicielkach, można podzielić, przenieść na naczynie powleczone Geltrexem i utrzymywać przez dwa pasaże przed transfekcją w warunkach bez karmicielek.
<ol>
	<li>Rozmrozić Geltrex przez noc w temperaturze 4°C. Aby przygotować powłokę z Geltrex, rozcieńczyć rozmrożony Geltrex w stosunku 1:50 w zimnym DMEM. Delikatnie wymieszać roztwory.</li>
</ol>
Uwaga: Geltrex, podobnie jak Matrigel, jest rozpuszczalną formą macierzy błony podstawnej oczyszczoną z mysich komórek nowotworowych Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Alternatywnie, w celu ustanowienia kultur ludzkich iPSC bez komórek wspierających (feeder-free), można zastosować Matrigel jako macierz pozakomórkową.
<ol start="2">
	<li>Pokryj całą powierzchnię studni hodowlanych roztworem Geltrex (1 ml dla studni o średnicy 35 mm). Pozostaw studnie pokryte Geltrexem w inkubatorze w temperaturze 37°C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Aby przeprowadzić pasaż ludzkich iPSC, dodaj 1 ml accutase do każdej studni i inkubuj w temperaturze 37°C przez 1 min, aż większość komórek zacznie się odklejać.</li>
</ol>
Aby przeprowadzić pasaż ludzkich iPSC, należy dodać 1 ml accutase do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37°C przez 1 min, aż większość komórek zacznie się odrywać.
<ol start="4">
	<li>Do komórek dodać 10-15 szklanych kulek i delikatnie zakręcić płytką. Dodać 2 ml KnockOut DMEM/ F12 i delikatnie potryturyzować. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki do wirowania o pojemności 10 ml.</li>
	<li>Wirować komórki przy 80 rpm przez 3 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odssać supernatant z probówki, pozostawiając nienaruszony osad ludzkich iPSC. Delikatnie uderzyć w probówkę, aby rozbić osad komórkowy.</li>
	<li>Usunąć Geltrex z powlekanej studni.</li>
	<li>Delikatnie resuspender osad ludzkich iPSC w odpowiedniej objętości STEMPRO. Rozdzielić między studnie z komórkami karmidłowymi, w zależności od tempa proliferacji. Ludzkie iPSC można pasażować w stosunku rozcieńczenia od 1:2 do 1:6.</li>
	<li>Ostrożnie umieścić w inkubatorze z 5% CO2, delikatnie zakręcić płytką, aby zapewnić równomierny rozkład komórek w studniach.</li>
	<li>Dokarmiać komórki codziennie, aż będą gotowe do ponownego pasażowania (gdy komórki osiągną 80% konfluencji).</li>
	<li>Pasażować ludzkie iPSC do nowej studni powlekanej Geltrexem (kroki 1.3 do 1.9) w stosunku rozcieńczenia 1:2. Przed transfekcją na studni powlekanej Geltrexem powinny utworzyć się małe kolonie, rozmieszczone równomiernie.</li>
</ol>
2. Transfekcja ludzkich iPSC przy użyciu GeneJuice
Komórki (hodowane na płytkach 6-dołkowych) w dniu transfekcji powinny osiągnąć około 40–50% konfluencji, aby uzyskać optymalną wydajność transfekcji. Wymiana pożywki komórkowej nie jest konieczna aż do następnego dnia.
<ol>
	<li>Przygotuj 10 μl KO-DMEM/F12 w sterylnej probówce typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml. Dodaj 27 μl odczynnika do transfekcji GeneJuice. Wymieszaj dokładnie. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 min.</li>
	<li>Dodaj 4 μg plazmidowego DNA. Inkubuj probówkę w temperaturze pokojowej przez 15 min. Wybór plazmidu jest kluczowy dla optymalnej wydajności transfekcji. Stosujemy plazmid zawierający białko zielonej fluorescencji o zwiększonej intensywności (eGFP) pod kontrolą promotora CAG5 (pCAG-eGFP). Promotor CAG jest silnym promotorem, który jest aktywny transkrypcyjnie w ludzkich iPSC, a zatem może być wykorzystany do sterowania ekspresją transgenu w tych komórkach. W naszych badaniach linearyzacja plazmidu nie wydawała się wpływać na wydajność transfekcji.</li>
	<li>Dodaj mieszaninę GeneJuice-DNA do komórek i delikatnie zakręć płytką. Wiruj płytkę przy 1200 rpm przez 5 minut (metoda „spinokulacji”), aby zwiększyć kontakt mieszaniny transfekcyjnej z ludzkimi iPSC w dołku.</li>
	<li>Inkubuj komórki w temperaturze 37°C przez noc.</li>
	<li>Następnego dnia monitoruj wydajność transfekcji.</li>
	<li>W przypadku transfekcji stabilnej, następnego dnia wymień medium na świeże STEMPRO. Po 24–48 godzinach dodaj odpowiedni antybiotyk selekcyjny.</li>
</ol>
3. Nukleofekcja ludzkich iPSC
Ludzkie iPSC hodowane na komórkach feederowych lub Geltrex mogą być wykorzystywane do nukleofekcji. Jednakże zdecydowanie zalecamy ponowne wysiewanie nukleofektowanych ludzkich iPSC na feederach z embrionalnych fibroblastów mysich (MEF) lub fibroblastów prątków ludzkiej przesłonki (HFF), aby zapewnić wysoką żywotność i regenerację komórek. W celu uzyskania wyższej przeżywalności komórek po nukleofekcji należy użyć co najmniej 2 milionów komórek.
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę warunkowaną (CM) z komórkami karmicielami poprzez inkubację pożywki KOSR (human iPSC KnockOut Serum Replacement) z komórkami karmicielami przez noc. Pobierać CM co 24 godziny.</li>
</ol>
Uwaga: Każda szczep myszy używana do przygotowywania warstw pożywczych (np. BLK6, CF1 i MF1) nadaje się do wytwarzania CM.
<ol start="2">
	<li>W dniu nukleofekcji poddać ludzkie iPSC działaniu 10 μM inhibitora ROCK przez co najmniej 1 godzinę.</li>
	<li>Przygotować 82 μl roztworu do nukleofekcji komórek macierzystych człowieka w sterylnej probówce Eppendorfa o pojemności 1,5 ml. Dodać 18 μl suplementu 1. Dokładnie wymieszać. Inkubować roztwór w temperaturze 37°C przez 5 minut.</li>
	<li>Podgrzać do 37°C pożywkę warunkowaną komórkami karmidłowymi (CM) oraz 0,25% trypsynę/EDTA. W komorze z laminarnym przepływem powietrza odpowiednio opisać jedną sterylną probówkę stożkową o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć pożywkę z hodowli ludzkich iPSC przeznaczonych do nukleofekcji. Delikatnie przemyć komórki 2 ml 1X roztworu buforu fosforanowego (PBS) na studzienkę. Odessać PBS. Dodać 1 ml 0,25% trypsyny na studzienkę. Inkubować komórki w temperaturze 37°C przez 3 minuty.</li>
	<li>Delikatnie triturować komórki za pomocą końcówki pipety o pojemności 10 μl. Przemyć dno studzienki, aby upewnić się, że wszystkie ludzkie iPSC zostały całkowicie odklejone. Przenieść zawiesinę komórkową do opisanej probówki stożkowej 15 ml.</li>
</ol>
Uwaga: Należy ściśle unikać trypsynizacji do pojedynczych komórek. Komórki powinny być oddzielane jedynie w postaci małych skupisk składających się z w przybliżeniu trzech komórek. Małe skupiska komórek (triplety komórkowe) ulegną dysocjacji do pojedynczych komórek podczas dalszej obróbki.
<ol start="7">
	<li>Dodaj 9 ml pożywki MEF, aby dezaktywować trypsynę. Wirować komórki przy 800 rpm przez 3 min. Ostrożnie odessać nadsącz, pozostawiając nienaruszony pellet komórkowy.</li>
	<li>Resuspendować komórki w podgrzanych do odpowiedniej temperatury 10 μl roztworu do nukleofekcji ludzkich komórek macierzystych z kroku 3.3.</li>
	<li>Przenieść komórki do kuwety nukleofektora za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Dodać 4 μg plazmidowego DNA do zawiesiny komórkowej w kuwecie. Wymieszać komórki i DNA delikatnie potrząsając kuwetą. Dwukrotnie uderzyć kuwetą o powierzchnię dygestorium.</li>
	<li>Włożyć kuwetę do uchwytu nukleofektora. Użyć programu B-016. Przeprowadzić nukleofekcję komórek, naciskając przycisk X.</li>
</ol>
&lt;<ok>&gt; pojawi się po zakończeniu procesu nukleofekcji (zwykle trwa on tylko 1–5 sekund). Zastosowanie innych programów nukleofekcji (A-023, A-03 i U-023) pozwoliło uzyskać mniej niż 10% komórek eGFP-dodatnich z ludzkich iPSC.</ok>
<ol start="12">
	<li>Odbierz nukleofektowane komórki z kuwety, używając dołączonej plastikowej pipety Pasteura. Odzyskaj komórki, resuspendując je w uprzednio ogrzanym CM i inhibitorze ROCK w sterylnej probówce Eppendorf o pojemności 1,5 ml. Inkubuj komórki w temperaturze 37°C przez 10 min, aby umożliwić ich regenerację.</li>
	<li>Przenieś komórki kroplami na warstwy komórek karmicieli, używając końcówki do pipety 1 ml. Inkubuj komórki w temperaturze 37°C przez noc.</li>
	<li>Następnego dnia sprawdź wydajność transfekcji. Aby wyizolować stabilne klony transgenicznych ludzkich iPSC stabilnie wykazujących ekspresję transgenu, wymień następnego dnia medium na CM z inhibitorem ROCK. Po 24–48 godzinach dodaj odpowiedni antybiotyk do selekcji.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
<img alt="Komórki wykazujące ekspresję eGFP w mikroskopii fazokontrastowej i fluorescencyjnej; schemat przedstawiający poziomy ekspresji." src="/files/ftp_upload/3110/3110fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Mikrofotografie ludzkich iPSC Riv1 przetransfekowanych pCAG-eGFP. (A) Komórki Riv1 wykazujące ekspresję eGFP, przetransfekowane za pomocą GeneJuice na Geltrex 12 godzin po transfekcji. Kolonie ludzkich iPSC Riv1 wysiane i uformowane na komórkach dokarmiających po nukleofekcji z zastosowaniem programu B-016 (B) oraz A-023 (C). (D) Kolonie ludzkich iPSC ze stabilną ekspresją eGFP z powszechną ekspresją eGFP uzyskaną za pomocą GeneJuice. (E) Stabilnie przetransfekowane ludzkie iPSC Riv1 zachowały konstytutywną ekspresję eGFP podczas różnicowania w ciała embrionalne.

<ol><li>Liew, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells%3A+possibilities+for+human+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Med%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells: possibilities for human cell transplantation.</a> Ann Med. 37, 521-532 (2005).</li>
<li>Eiges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+embryonic+stem+cell-transfected+clones+carrying+a+marker+for+undifferentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells.</a> Curr Biol. 11, 514-518 (2001).</li>
<li>Zwaka, T. P., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogous+recombination+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Homogous recombination in human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 21, 319-321 (2003).</li>
<li>Siemen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Nucleofection of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells Dev. 14, 378-383 (2005).</li>
<li>Liew, C. G., Draper, J. S., Walsh, J., Moore, H., Andrews, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+stable+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).</li>
<li>Xia, X., Ayala, M., Thiede, B. R., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-+and+in+vivo-induced+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+and+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">In vitro- and in vivo-induced transgene expression in human embryonic stem cells and derivatives.</a> Stem Cells. 26, 525-533 (2008).</li>
<li>Braam, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+genetic+manipulation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 5, 389-392 (2008).</li>
<li>Braam, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+culture+of+human+embryonic+stem+cells+in+conditioned+medium+for+efficient+genetic+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Feeder-free culture of human embryonic stem cells in conditioned medium for efficient genetic modification.</a> Nat Protoc. 3, 1435-1443 (2008).</li>
<li>Hohenstein, K. A., Pyle, A. D., Chern, J. Y., Lock, L. F., Donovan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+mediates+high-efficiency+stable+gene+knockdown+and+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Nucleofection mediates high-efficiency stable gene knockdown and transgene expression in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26, 1436-1443 (2008).</li>
<li>Placantonakis, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAC+transgenesis+in+human+embryonic+stem+cells+as+a+novel+tool+to+define+the+human+neural+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">BAC transgenesis in human embryonic stem cells as a novel tool to define the human neural lineage.</a> Stem Cells. 27, 521-532 (2009).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Nasze protokoły pozwalają na zastosowanie prostych, solidnych i wysoce powtarzalnych technik wprowadzania transgenów do ludzkich iPSC bez występowania wyraźnych efektów toksycznych i śmierci komórkowej. Ludzkie iPSC powinny być pasażowane w formie małych skupisk komórek (5-10 komórek) i wysiewane na Geltrex z wysoką gęstością (1:2), aby zapewnić optymalną wydajność transfekcji w licznych małych koloniach. W przypadku linii ludzkich iPSC bardziej podatnych na różnicowanie i śmierć komórkową, do jednego eksperymentu z nukleofekcją należy użyć większej liczby ludzkich iPSC (do 4 X 106 komórek). Test transfekcji przejściowej generuje dużą liczbę ludzkich iPSC wykazujących ekspresję transgenu w ciągu 1 dnia. Stabilnie transfektowane klony iPSC pojawiają się zazwyczaj w ciągu 7 dni, a te kolonie transgeniczne powinny być gotowe do wyselekcjonowania w ciągu trzech tygodni. Zastosowanie opisanego tutaj promotora CAG zapewnia powszechną ekspresję reportera eGFP. Dzięki takim usprawnieniom nasze protokoły mogą być wykorzystywane w innych zastosowaniach, w tym do nadekspresji, indukcji warunkowej, wyprowadzania linii reporterowych specyficznych dla danej linii komórkowej, wyciszania za pomocą shRNA lub siRNA, celowania w geny oraz rekombinacji homologicznej.

<table><tbody><tr><td>0,25% trypsyny z EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>2-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>szklane kuleczki 3 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-312A</td><td>Szklane kuleczki należy myć kwasem solnym (HCl) przez noc, przepłukać wodorotlenkiem sodu (NaOH) i wodzie destylowanej, a następnie wysterylizować w autoklawie przed użyciem.</td></tr><tr><td>odczyn do dysocjacji komórek Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0263</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (wysoka zawartość glukozy)</td><td>Lonza Inc.</td><td>12-741 F</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica cielęca</td><td>Invitrogen</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Invitrogen</td><td>12760013</td><td>z obniżoną zawartością czynników wzrostu</td></tr><tr><td>odczyn do transfekcji GeneJuice</td><td>EMD Millipore</td><td>70967</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax-I (100X)</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td>Zamiast niego można również stosować L-glutaminę (Invitrogen, 25030081).</td></tr><tr><td>pożywka KOSR dla ludzkich iPSC</td><td></td><td></td><td>500 ml pożywki dla ludzkich ES składa się z 390 ml KnockOut DMEM/F12, 100 ml zamiennika surowicy KnockOut, 5 ml Glutamax-I (100X), 5 ml NEAA (100X), 500 &amp;#x03BC;l 2-merkapto&amp;#8211;etanolu (55mM) i jest uzupełniona o 10 ng/ml bFGF.</td></tr><tr><td>KnockOut DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12660-012</td><td></td></tr><tr><td>zamiennik surowicy KnockOut (KOSR)</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>pożywka dla embrionalnych fibroblastów mysich</td><td></td><td></td><td>pożywka MEF składa się z 90% FBS, 1X NEAA, 1X Glutamax-I i 1X pirogronianu sodu w DMEM (wysoka zawartość glukozy)</td></tr><tr><td>niezbędne aminokwasy, NEAA (100X)</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>roztwór nuklefektora 1 dla ludzkich komórek macierzystych z suplementem</td><td>Lonza Inc.</td><td>VAPH-5012</td><td></td></tr><tr><td>fosforanowy bufor solny bez Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; i Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>pirogronian sodu (100X)</td><td>Invitrogen</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>zestaw pożywkowy STEMPRO</td><td>Invitrogen</td><td>A1000701</td><td>500 ml pożywki STEMPRO składa się z 454 ml KnockOut DMEM/F12, 10 ml bezsurowiczego suplementu wzrostowego STEMPRO (50X), 5 ml Glutamax-I (100X), 5 ml NEAA (100X), 36 ml BSA (albumina surowicy bydlęcej, 25%), 909 &amp;#x03BC;l 2-merkapto&amp;#8211;etanolu (55mM) i jest uzupełniona o 10 ng/ml bFGF.</td></tr></tbody></table>

transfekcja i nukleofekcja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Modyfikacje genetyczne pozostają kluczowym narzędziem w badaniu biologii komórek macierzystych oraz w opracowywaniu potencjalnych zastosowań klinicznych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (HESCs)1. Choć opisano ulepszenia w kilku metodach dostarczania genów2-9, transfekcja w przypadku HESCs wciąż pozostaje procesem nieprzewidywalnym, a w przypadku ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSCs) nie została jeszcze w pełni opisana. W tym filmie prezentujemy, jak w naszym laboratorium rutynowo przeprowadzamy transfekcję i nukleofekcję ludzkich iPSCs z wykorzystaniem plazmidu z reporterem białka zielonej fluorescencji (eGFP). Ludzkie iPSCs są adaptowane i hodowane w warunkach bezkarmiących (feeder-free), aby wyeliminować możliwość transfekcji komórek karmiących oraz umożliwić efektywną selekcję stabilnych transgenicznych klonów iPSC po transfekcji. W przypadku nukleofekcji, ludzkie iPSCs są wstępnie traktowane inhibitorem ROCK11, trypsynizowane do postaci małych skupisk komórek, nukleofektowane, a następnie wysiewane na komórki karmiące w pożywce warunkowanej przez komórki karmiące, aby zwiększyć przeżywalność komórek. Ludzkie iPSCs wykazujące ekspresję transgenu mogą zostać otrzymane po 6 godzinach. Selekcję antybiotykową stosuje się po 24 godzinach, a stabilne linie transgeniczne pojawiają się w ciągu 1 tygodnia. Nasz protokół jest skuteczny i powtarzalny dla linii ludzkich iPSC, nie wpływając na pluripotencjalność tych komórek.

Pomimo niedawnych postępów w modyfikacjach genetycznych, transfekcja ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (HESCs) pozostaje procesem nieprzewidywalnym. Według naszej wiedzy, w literaturze nie opisano systematycznych i wydajnych metod transfekcji ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSCs). W niniejszej pracy opisujemy niezawodne protokoły wydajnej transfekcji i nukleofekcji ludzkich iPSCs.

Transfekcja i nukleofekcja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Modyfikacje genetyczne wciąż stanowią niezbędne narzędzie w badaniach nad biologią komórek macierzystych oraz w opracowywaniu potencjalnych zastosowań klinicznych komórek ludzkich...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest osiągnięcie wysokiej wydajności transfekcji w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu zoptymalizowanych protokołów transfekcji i nukleofekcji. Zostaje to osiągnięte poprzez uprzednie ustanowienie kultur ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych bez użycia komórek karmicieli. Do transfekcji ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste są wysiewane na gelt, TRX lub matrigel na noc.Podczas nuklefekcji, za pomocą trypsyny uzyskuje się małe skupiska komórek, do których dodaje się mieszaninę plazmidowego DNA i odczynnika do transfekcji genów, a następnie płytkę wiruje i inkubuje w temperaturze 37°C. Zawiesinę ludzkich komórek iPS poddaje się nuklefekcji za pomocą urządzenia do nuklefekcji, a następnie komórki resuspendsuje się w pożywce warunkowanej i inkubuje w temperaturze 37°C. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące efektywną manipulację genetyczną dzięki wysokiej wydajności transfekcji w ludzkich komórkach iPS.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wcześniej opisana elektroporacja do transfekcji oraz metody nukleofekcji, jest możliwość rutynowego osiągania wysokiej wydajności transfekcji w ludzkich komórkach iPS przy spójnych wynikach w naszym laboratorium. Nasze protokoły zapewniają również minimalną śmiertelność komórek po modyfikacji genetycznej. W związku z tym nasze protokoły umożliwiają szybkie i wielkoskalowe generowanie transgenicznych linii ludzkich komórek iPS. Przed adaptacją ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do kultur bez karmicieli należy przygotować naczynia pokryte Geltrex.Następnie należy poddać masażowi ludzkie IPCs, utrzymywane wcześniej na komórkach karmicielkach, dodając 1 ml Accutane na dołek i inkubować w temperaturze 37 °C przez jedną minutę, aż większość komórek zacznie się odrywać; następnie dodać 10 do 15 szklanych kulek do komórek i delikatnie potrząsnąć płytką. Następnie dodać 2 ml knockout D-M-E-M-F 12 i delikatnie utriturować. Zawiesinę komórkową przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 10 ml.Wirować komórki z prędkością 800 RPM przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Odessać nadsącz, pozostawiając nienaruszony osad ludzkich iPSC. Delikatnie uderzyć w probówkę, aby łagodnie rozbić osad komórkowy.Reese, zawieś osad ludzkich iPSC w odpowiedniej objętości pożywki STEM pro i rozdziel go pomiędzy dołki płytki pokrytej TRE gel. W zależności od tempa proliferacji, ludzkie IPC można pasażować w stosunku rozcieńczenia od 1:2 do 1:6. Ostrożnie umieść płytkę w inkubatorze z 5% carbon dioxide w temperaturze 37 degrees Celsius i delikatnie zakręć płytką, aby zapewnić równomierny rozkład komórek w dołkach.Dokarmiaj komórki codziennie. Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, są gotowe do ponownego pasażowania na nowy żel. W dniu transfekcji, aby uzyskać optymalną wydajność, komórki w dołkach pokrytych Rex przy stosunku rozcieńczenia 1:2 powinny wykazywać konfluencję na poziomie około 40–50% i tworzyć małe kolonie rozmieszczone równomiernie w dołku pokrytym żelem.Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować 100 µL pożywki knockout w sterylnym probówce typu eppendorf o pojemności 1,5 mL. Dodać 27 µL odczynnika do transfekcji gene juice, dokładnie wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie dodać 4 µg plazmidowego DNA.Wybór plazmidu ma kluczowe znaczenie dla optymalnej wydajności transfekcji. Plazmid użyty w tej procedurze zawiera wzmocnione zielone białko fluorescencyjne pod kontrolą promotora CAG, który jest silnym promotorem aktywnym transkrypcyjnie w ludzkich IPC. Inkubuj probówkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut.Po 15 minutach dodać mieszaninę DNA (gene juice) do komórek i rozprowadzić ją na płytce. Wirować płytkę z prędkością 1 200 RPM przez pięć minut, aby zwiększyć kontakt mieszaniny transfekcyjnej z ludzkimi IPC w dołkach. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez noc do następnego dnia.W dniu nukleofekcji należy monitorować wydajność transfekcji; w celu przygotowania ludzkich iPSC należy je wstępnie inkubować z 10 µM inhibitorem ROCK przez co najmniej jedną godzinę w temperaturze 37 °C. W sterylnym probówce typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml przygotować 82 µl roztworu do nukleofekcji ludzkich komórek macierzystych. Dodać 80 µl.Uzupełnić do odpowiedniej objętości i dobrze wymieszać za pomocą pipetowania. Inkubować roztwór w temperaturze 37 °C przez pięć minut. Poddygestorem podgrzać do 37 °C wcześniej przygotowane medium warunkowane komórkami karmicielnymi oraz 0,25% trypsyny w EDTA.Należy opisać jedną sterylną probówkę stożkową o pojemności 15 ml. Ostrożnie usunąć medium z hodowli ludzkich iPSC przeznaczonej do transferu jąder i delikatnie przemyć komórki solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS). Odessać PBS i dodać trypsynę, a następnie inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez trzy minuty.Dla skutecznej nuklefekcji krytyczne jest, aby nie trawić komórek trypsyną do postaci pojedynczych komórek. Zamiast tego komórki należy rozbić przez tryturację na małe skupiska składające się z dwóch do trzech komórek. Delikatnie rozbij komórki za pomocą końcówki pipety P 1000 na małe skupiska składające się z dwóch do trzech komórek.Wypłucz dno dołka poprzez wielokrotne pipetowanie, aby upewnić się, że wszystkie ludzkie IPC zostały całkowicie ododerwane. Następnie przenieś zawiesinę komórkową do oznakowanej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Następnie dodaj dziewięć mililitrów pożywki do zarodkowych fibroblastów mysich.Aby inaktywować trypsynę, wiruj komórki z prędkością 800 RPM przez trzy minuty. Ostrożnie odessij nadsącz, pozostawiając nienaruszony osad komórkowy. Resuspenduj komórki w 100 µL podgrzanego wcześniej roztworu efektora jądrowego dla ludzkich komórek macierzystych.Używając końcówki do pipety o pojemności 1 mL, przenieś komórki do probówki typu V-bottom. Dodaj 4 µg plazmidowego DNA do zawiesiny komórkowej w probówce, a następnie wymieszaj komórki i DNA delikatnie okrężnymi ruchami. Stuknij probówkę dwukrotnie o powierzchnię dygestorium.Włóż probówkę do uchwytu efektora jądrowego w urządzeniu do elektroporacji jądra. Wybierz program B 0 1 6 dla komórek poddawanych elektroporacji jądra, naciskając przycisk x; na wyświetlaczu pojawi się komunikat Okay. Po zakończeniu procesu elektroporacji jądra, co zazwyczaj trwa od jednej do pięciu sekund, użyj dołączonej do zestawu plastikowej pipety Pasteura, aby pobrać komórki po elektroporacji z probówki. Odzyskaj komórki poprzez resuspensję w uprzednio ogrzanym medium CM i inhibitorze ROCK w sterylnym probówce typu eppendorf o pojemności 1,5 ml. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez 10 minut.Po 10 minutach, używając końcówki do pipety o objętości 1 ml, przenieś komórki kroplami na warstwy komórek karmicieli. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez noc do następnego dnia. Monitoruj wydajność transfekcji.Przedstawione tutaj mikrofotografie ukazują ludzkie komórki iPSC linii RIV one wykazujące ekspresję EGFP, które zostały transfekowane za pomocą odczynnika Gene Juice na żelu Rex 12 godzin po transfekcji. Transfekcja DNA ludzkich iPSCs przy użyciu Gene Juice z silnym promotorem zazwyczaj daje ponad 60% komórek wykazujących ekspresję reportera EGFP w teście transfekcji przejściowej.Komórki wykazujące ekspresję EGFP można uzyskać również poprzez transfekcję jądrową, co przedstawiono na obrazach ludzkich iPSC RIV one, wysianych i uformowanych na komórkach karmicielkach po transfekcji jądrowej z wykorzystaniem programu transfekcji jądrowej B 0 1 6 lub programu transfekcji jądrowej A 0 2 3. Zastosowanie programu B 0 1 6 skutkuje uzyskaniem do 80% komórek pozytywnych pod kątem EGFP, natomiast program A 0 2 3 przyniósł mniej niż 10% komórek pozytywnych pod kątem EGFP. Ponadto możliwe jest wyizolowanie stabilnych klonów transgenicznych ludzkich iPSC wykazujących ekspresję genu trends.Tutaj przedstawiono przykład stabilnie ekspresyjnych kolonii ludzkich iPSC z powszechną ekspresją EGFP pochodzącą z gene juice. Komórki te zachowują konstytutywną ekspresję EGFP podczas różnicowania w ciała zarodkowe. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić nuklefekcję i transfekcję ludzkich komórek iPS.Efektywna manipulacja genetyczna stanowi niezbędne narzędzie do badania różnych aspektów biologii komórek macierzystych i przyspieszy zastosowanie ludzkich linii komórek iPS w medycynie regeneracyjnej.

transfecting-and-nucleofecting-human-induced-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Transfekcja i nukleofekcja ludzkich indukowanych komórek pluripotencjalnych

Wprowadzenie interesującego genu do komórki jest potężną metodą wyjaśniania jego funkcji in vivo. Niniejszy protokół opisuje wydajną metodę transfekcji hodowli ludzkich neuralnych komórek macierzystych/prekursorowych (hNSPCs) przy użyciu aparatu do elektroporacji Nucleofector firmy Amaxa.

Transfekcja ludzkich neuralnych komórek macierzystych za pomocą nukleofektora Amaxa

Zestaw lentiwirusów Stemgent Dox Inducible Mouse TF umożliwia reprogramowanie embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs) do indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS). W niniejszym materiale przedstawiamy protokół indukcji ekspresji mysich czynników transkrypcyjnych reprogramujących Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc za pomocą doksycykliny (DOX) w celu wytworzenia kolonii iPS wykazujących ekspresję typowych markerów pluripotencji mES.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez reprogramowanie embrionalnych fibroblastów myszy z wykorzystaniem indukowanego doksycykliną lentiwirusowego systemu transdukcji czterech czynników transkrypcyjnych

Przedstawiamy protokół generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych przy użyciu dostarczania czynników ludzkich Oct4, Sox2, Nanog i Lin28 za pomocą lentiwirusów. Pluripotencjalność potwierdzono na podstawie morfologii oraz obecności markerów specyficznych dla embrionalnych komórek macierzystych (ES).

Generowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych poprzez przeprogramowanie ludzkich fibroblastów za pomocą zestawu ludzkich lentiwirusów TF firmy Stemgent

Przedstawiamy protokół efektywnego przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych w ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) przy użyciu wektorów retrowirusowych kodujących Oct3/4, Sox2, Klf4 i c-myc (OSKM) oraz metodę identyfikacji prawidłowo przeprogramowanych hiPSC poprzez barwienie żywych komórek przeciwciałem Tra-1-81.

Wybór i izolacja kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przeprogramowanych z fibroblastów dorosłych

Opisano metodę generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) poprzez transdukcję retrowirusową prowadzącą do ektopowej ekspresji czynników OCT4, SOX2, KLF4 i MYC. Omówiono również praktyczny sposób identyfikacji kolonii ludzkich iPSC na podstawie ekspresji GFP.

Reprogramowanie ludzkich komórek somatycznych w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) przy użyciu wektora retrowirusowego z GFP

Tutaj prezentujemy naszą sprawdzoną metodę przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych na wolne od transgenów ludzkie iPSC z wirusem Sendai, która wykazuje spójne wyniki i zwiększoną efektywność.

Wydajna generacja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych z wirusem Sendai

Opisujemy protokół wyprowadzania opartych na lentiwirusach, przeprogramowanych i scharakteryzowanych, bezczynnikowo indukowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i przekształcania ich w domniemane warunki kliniczne.

Uzyskanie i charakterystyka wolnej od transgenów indukowanej przez człowieka pluripotencjalnej linii komórek macierzystych i konwersja do określonych stanów klinicznych

Ten protokół opisuje efektywną indukcję hemogennego śródbłonka i wielopotencjalnych hematopoetycznych komórek progenitorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych.

Bezpośrednia indukcja hemogennego śródbłonka i krwi przez nadekspresję czynników transkrypcyjnych w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych

Ten manuskrypt przedstawia krok po kroku procedurę pozyskiwania i utrzymywania ludzkich keratynocytów z wyrwanych włosów oraz późniejszej generacji wolnych od integracji ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) za pomocą wektorów epizodycznych.

Generowanie bezintegracyjnych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu keratynocytów pochodzących z włosów

Tutaj opisujemy szczegółową metodę bezproblemowej edycji genów w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu plazmidu dawcy opartego na piggyBac i mutanta nickazy Cas9. Do eksonu 8 locus czynnika jądrowego hepatocytów 4 alfa (HNF4α) w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (hESC) wprowadzono dwie mutacje punktowe.

Wprowadzenie mutacji punktowych do ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu płynnej edycji genomu

Poznaj zoptymalizowane protokoły transfekcji i nukleofekcji ludzkich komórek iPSC, które zapewniają wysoką wydajność przy minimalnej śmierci komórek. Metody te umożliwiają generowanie linii transgenicznych.

Transfekcja i nukleofekcja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów