Izolowanie komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej myszy okołoortowej

Weźmy pobrane transgeniczne tkanki tłuszczowe okołoaortalne myszy zawierające fluorescencyjne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej wyrażające białko fluorescencyjne, pochodzące z komórek grzebienia nerwowego lub NCC.

Dodaj pożywkę trawiącą i zmiel tkanki.

Przenieść zmieloną tkankę z pożywką wytrawiającą do probówki. Mechanicznie odciąć fragmenty.

Inkubować. Kolagenaza w pożywce trawi macierz zewnątrzkomórkową tkanki, uwalniając komórki macierzyste, adipocyty i fibroblasty.

Dodaj pożywkę zawierającą surowicę, aby zatrzymać aktywność kolagenazy. Odwirować i wyrzucić supernatant zawierający adipocyty.

Ponownie zawieś komórki w pożywce i przefiltruj, aby usunąć agregaty.

Odwirować filtrat i usunąć sklarowany nad osadem. Ponownie zawiesić komórki w buforze do lizy erytrocytów w celu lizy erytrocytów.

Dodaj bufor zawierający surowicę, aby zatrzymać lizę. Odwirować i wyrzucić supernatant.

Ponownie zawieś komórki w buforze.

Wykonaj sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, aby wyizolować fluorescencyjne komórki macierzyste.

Wyizolowane komórki macierzyste mogą być wykorzystane do dalszych eksperymentów.

Przenieś pobraną tkankę tłuszczową do nowej 2-mililitrowej probówki do mikrowirówki, zawierającej 1 mililitr świeżo przygotowanej pożywki trawiącej i użyj nożyczek chirurgicznych do zmielenia tkanek. Przenieś zawiesinę tkanek do 50-mililitrowej probówki zawierającej 9 mililitrów świeżej pożywki do trawienia i użyj 1-mililitrowej pipety, aby 10-krotnie rozcierać tkanki.

Po uzyskaniu jednorodnego roztworu inkubować probówkę przez 30 do 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 100 obrotach na minutę, sprawdzając co 5 do 10 minut, aby zapobiec nadmiernemu trawieniu. Gdy po delikatnym zawirowaniu rurki można zaobserwować jasnożółty jednorodny roztwór tkanki tłuszczowej, należy przerwać trawienie za pomocą 5 mililitrów HDMEM uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą. Po dokładnym wymieszaniu odwirować próbkę tkanki tłuszczowej.

Frakcja komórek naczyniowych zrębu będzie widoczna jako brązowawy osad. Ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach pożywki hodowlanej i przefiltrować zawiesinę komórek przez sitko do komórek o średnicy 70 mikrometrów.

Zebrać komórki przez kolejne odwirowanie i delikatnie ponownie zawiesić osad w 5 mililitrach buforu do lizy erytrocytów. Przenieś zawieszenie do 15-milimetrowej rury. Po 10 minutach zatrzymaj reakcję za pomocą dwóch wirowań w 10 mililitrach PBS, uzupełnionych 1% płodową surowicą bydlęcą.

Po drugim odwirowaniu ponownie zawiesić osad w 5 mililitrach pożywki hodowlanej na lodzie i zebrać komórki za pomocą końcowego odwirowania. Następnie ponownie zawieś komórki w 5 mililitrach bufora FACS w celu zliczenia.

Aby skonfigurować kulturę NCADSC po ich izolacji przez FACS zgodnie ze standardowymi protokołami, umieść komórki w stężeniu 5 x 10³ komórek na cm² w każdej studzience, 12-dołkowej płytce hodowlanej w kompletnej pożywce hodowlanej, w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 20 do 24 godzin. Następnego dnia umyj komórki PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza i nakarm kulturę świeżą pożywką hodowlaną.