Izolowanie komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej myszy okołoortowej
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:52 min • July 8th, 2025
Weźmy pobrane transgeniczne tkanki tłuszczowe okołoaortalne myszy zawierające fluorescencyjne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej wyrażające białko fluorescencyjne, pochodzące z komórek grzebienia nerwowego lub NCC.
Dodaj pożywkę trawiącą i zmiel tkanki.
Przenieść zmieloną tkankę z pożywką wytrawiającą do probówki. Mechanicznie odciąć fragmenty.
Inkubować. Kolagenaza w pożywce trawi macierz zewnątrzkomórkową tkanki, uwalniając komórki macierzyste, adipocyty i fibroblasty.
Dodaj pożywkę zawierającą surowicę, aby zatrzymać aktywność kolagenazy. Odwirować i wyrzucić supernatant zawierający adipocyty.
Ponownie zawieś komórki w pożywce i przefiltruj, aby usunąć agregaty.
Odwirować filtrat i usunąć sklarowany nad osadem. Ponownie zawiesić komórki w buforze do lizy erytrocytów w celu lizy erytrocytów.
Dodaj bufor zawierający surowicę, aby zatrzymać lizę. Odwirować i wyrzucić supernatant.
Ponownie zawieś komórki w buforze.
Wykonaj sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, aby wyizolować fluorescencyjne komórki macierzyste.
Wyizolowane komórki macierzyste mogą być wykorzystane do dalszych eksperymentów.
Przenieś pobraną tkankę tłuszczową do nowej 2-mililitrowej probówki do mikrowirówki, zawierającej 1 mililitr świeżo przygotowanej pożywki trawiącej i użyj nożyczek chirurgicznych do zmielenia tkanek. Przenieś zawiesinę tkanek do 50-mililitrowej probówki zawierającej 9 mililitrów świeżej pożywki do trawienia i użyj 1-mililitrowej pipety, aby 10-krotnie rozcierać tkanki.
Po uzyskaniu jednorodnego roztworu inkubować probówkę przez 30 do 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 100 obrotach na minutę, sprawdzając co 5 do 10 minut, aby zapobiec nadmiernemu trawieniu. Gdy po delikatnym zawirowaniu rurki można zaobserwować jasnożółty jednorodny roztwór tkanki tłuszczowej, należy przerwać trawienie za pomocą 5 mililitrów HDMEM uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą. Po dokładnym wymieszaniu odwirować próbkę tkanki tłuszczowej.
Frakcja komórek naczyniowych zrębu będzie widoczna jako brązowawy osad. Ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach pożywki hodowlanej i przefiltrować zawiesinę komórek przez sitko do komórek o średnicy 70 mikrometrów.
Zebrać komórki przez kolejne odwirowanie i delikatnie ponownie zawiesić osad w 5 mililitrach buforu do lizy erytrocytów. Przenieś zawieszenie do 15-milimetrowej rury. Po 10 minutach zatrzymaj reakcję za pomocą dwóch wirowań w 10 mililitrach PBS, uzupełnionych 1% płodową surowicą bydlęcą.
Po drugim odwirowaniu ponownie zawiesić osad w 5 mililitrach pożywki hodowlanej na lodzie i zebrać komórki za pomocą końcowego odwirowania. Następnie ponownie zawieś komórki w 5 mililitrach bufora FACS w celu zliczenia.
Aby skonfigurować kulturę NCADSC po ich izolacji przez FACS zgodnie ze standardowymi protokołami, umieść komórki w stężeniu 5 x 103 komórek na cm2 w każdej studzience, 12-dołkowej płytce hodowlanej w kompletnej pożywce hodowlanej, w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 20 do 24 godzin. Następnego dnia umyj komórki PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza i nakarm kulturę świeżą pożywką hodowlaną.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół izolacji, hodowli oraz indukcji różnicowania adipogennego komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej wywodzących się z grzebienia neuronalnego (NCADSCs) z okołoaortalnej tkanki tłuszczowej myszy. Metoda ta wykorzystuje myszy transgeniczne wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych w komórkach grzebienia neuronalnego, co umożliwia precyzyjną identyfikację i sortowanie NCADSCs do dalszych zastosowań.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórek macierzystych
- Izolacja i hodowla komórek
- Badania nad tkanką tłuszczową
Wstęp
- Komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ADSCs) stanowią cenny zasób dla medycyny regeneracyjnej.
- ADSCs pochodzące z grzebienia nerwowego posiadają unikalne właściwości oraz pochodzenie rozwojowe.
- Izolacja czystych populacji NCADSCs wymaga zastosowania specyficznych technik znakowania i sortowania.
- Mysia tkanka tłuszczowa okołoaortalna służy jako źródło tych komórek macierzystych.
Cel badania
- Przedstawienie powtarzalnego protokołu izolacji fluorescencyjnie znakowanych NCADSCs z okołaoartycznej tkanki tłuszczowej myszy.
- Umożliwienie efektywnej hodowli i ekspansji posortowanych NCADSCs.
- Ułatwienie dalszych zastosowań, w tym indukcji adipogenezy oraz badań funkcjonalnych.
Zastosowane metody
- Pozyskiwanie tkanki tłuszczowej okołoaortycznej od myszy transgenicznych wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych w komórkach grzebienia neuronalnego.
- Mechaniczne rozdrobnienie i trawienie enzymatyczne (kolagenazą) tkanki tłuszczowej w celu uwolnienia komórek frakcji naczyniowo-stromalnej.
- Filtracja i liza erytrocytów w celu oczyszczenia zawiesiny komórkowej.
- Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) w celu wyizolowania fluorescencyjnych NCADSCs.
- Hodowla posortowanych NCADSCs w pożywce kompletnej w standardowych warunkach.
Główne wyniki
- Efektywna izolacja fluorescencyjnie znakowanych NCADSCs z tkanki tłuszczowej okołoaortalnej myszy.
- Usunięcie adypocytów i erytrocytów pozwala na uzyskanie oczyszczonej frakcji komórek śródmiąższowo-naczyniowych.
- Metoda FACS umożliwia selekcję komórek macierzystych pochodzących z grzebienia nerwowego do hodowli.
- Izolowane NCADSCs mogą być namnażane in vitro do dalszego wykorzystania w eksperymentach.
Wnioski
- Niniejszy protokół przedstawia niezawodną metodę izolacji i hodowli NCADSCs z tkanki tłuszczowej myszy.
- Znakowanie fluorescencyjne oraz FACS zapewniają wysoką czystość komórek macierzystych pochodzących z grzebienia neuronalnego.
- Technika ta wspiera dalsze zastosowania w biologii komórek macierzystych oraz badaniach nad tkanką tłuszczową.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej i grzebienia neuralnego (NCADSCs) z okołorticznej tkanki tłuszczowej myszy umożliwia walidację celów w modelach chorób metabolicznych i naczyniowych. Znakowanie fluorescencyjne i oczyszczanie metodą FACS zapewniają powtarzalny system ograniczania ryzyka mechanistycznego w terapiach komórkami macierzystymi. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w badaniach przesiewowych przedklinicznych poprzez zapewnienie homogeniczności komórkowej oraz możliwości śledzenia linii komórkowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie wkładu komórek macierzystych pochodzących z grzebienia neuralnego w homeostazę i patologię tkanki tłuszczowej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia oczyszczoną, znakowaną fluorescencyjnie populację komórek, co pozwala na uzyskanie spójnych wyników eksperymentalnych.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność co do celu badawczego poprzez izolację określonej frakcji naczyniowo-stromalnej do testów funkcjonalnych.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie standaryzowanego, żywotnego źródła komórek do różnicowania adipogennego i screeningu odpowiedzi na leki.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność testu poprzez eliminację zanieczyszczeń w postaci fibroblastów i adipocytów za pomocą FACS.
- Skalowalność: Umożliwia ekspansję klonalnych linii NCADSC w celu wysokoprzepustowego testowania związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy zachowanie komórek macierzystych in vitro z istotnością niszy tłuszczowej okołoaortycznej in vivo.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia ocenę potencjału adipogennego i różnicowania pozacelowego w modelu z prześledzeniem linii komórkowych.
- Model przedkliniczny: Wspiera testowanie regulatorów metabolicznych w kontekście istotnym dla choroby na styku naczyniowo-tłuszczowym.
Integracja potoku i przepływu pracy
Przebieg procesu izolacji wpisuje się w etap przejścia od wczesnej fazy odkrywania do badań przedklinicznych, zapewniając zdefiniowany materiał komórkowy do późniejszej walidacji funkcjonalnej oraz prac nad identyfikacją związków wiodących.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących roli komórek macierzystych grzebienia neuronalnego w zwłóknieniu i zapaleniu tkanki tłuszczowej.
- Przesiewanie: Dostarcza oczyszczoną, adherentną populację komórek gotową do ekspozycji na związki chemiczne i odczytów fenotypowych.
- Analityka: Umożliwia ilościową ocenę wydajności różnicowania i tempa proliferacji po izolacji.
- Badania translacyjne: Łączy zachowanie komórkowe z interakcjami naczyniowo-tłuszczowymi w modelach miażdżycy i otyłości.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy bankowalną, genetycznie identyfikowalną linię komórek macierzystych do ponownego wykorzystania w wielu projektach w ramach programów badań nad chorobami metabolicznymi.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez izolację genetycznie zdefiniowanej subpopulacji komórek macierzystych z heterogennej tkanki tłuszczowej.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje materiał wyjściowy dzięki oczyszczaniu metodą FACS, co poprawia powtarzalność między eksperymentami.
- Wartość strategiczna: Zwiększa wiarygodność decyzji go/no-go poprzez minimalizację zmienności w pobranych frakcjach komórek naczyniowo-stromalnych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków modulujących komórki macierzyste z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o odpowiedzi specyficzne dla danej linii komórkowej.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z tkankami mysimi, trawieniu enzymatycznym oraz sortowaniu komórek metodą FACS.
- Zależne od dostępu do kolagenazy, aparatury FACS oraz sterylnej infrastruktury do hodowli komórkowej.
- Wymaga standaryzacji czasu trawienia i buforów lizujących w celu zapewnienia spójnej wydajności frakcji naczyniowo-stromalnej.
- Adaptacja do innych depotów tłuszczowych może wymagać optymalizacji parametrów dysocjacji.
- Ograniczone przez specyficzność ekspresji transgenu; fluorescencja tła może wymagać zastosowania kontroli bramkowania.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Izolacja i różnicowanie komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej z podskórnych tkanek tłuszczowych świń
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Izolacja, proliferacja i różnicowanie komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej makaka rezusa
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Izolacja i hodowla ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej za pomocą innowacyjnej metody wolnej od ksenogenu w terapii u ludzi
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Izolacja komórek odpornościowych tkanki tłuszczowej
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Izolacja fragmentów mikronaczyniowych pochodzących z mysiej tkanki tłuszczowej jako jednostek unaczynienia dla inżynierii tkankowej
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Ekspansja i indukcja adipogenezy progenitorów adipocytów z okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej izolowanej przez magnetyczne sortowanie komórek aktywowanych
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Izolacja, hodowla i indukcja adipogenna grzebienia nerwowego Oryginalne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej okołoorciowej
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Izolacja adipogennych i włóknisto-zapalnych subpopulacji komórek zrębu z mysich wewnątrzbrzusznych magazynów tłuszczu
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Preparat komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej tkanki tłuszczowej najądrza myszy
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Izolacja i identyfikacja mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej szczurów Sprague Dawley
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Ostatnia aktualizacja: 29 sierpnia 2026