$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Zacznij od tkanki okołokomorowej rdzenia kręgowego dorosłego szczura, regionu bogatego w nerwowe komórki macierzyste / progenitorowe.
Przenieść tkankę do roztworu zawierającego papainę i DNazę.
Papaina, enzym proteolityczny, rozszczepia macierz zewnątrzkomórkową tkanki, podczas gdy DNaza degraduje zanieczyszczające DNA uwolnione z uszkodzonych komórek.
Mechanicznie zdysocjuj tkankę, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
Przenieść zawiesinę do probówki i odwirować. Usunąć supernatant. Ponownie zawiesić komórki w roztworze zawierającym białko albuminy i inhibitor proteazy.
Albumina i inhibitor dezaktywują papainę.
Zawiesinę komórkową należy nałożyć na roztwór zawierający albuminę i inhibitor proteazy.
Różnica gęstości między warstwami tworzy nieciągły gradient gęstości.
Wirować, aby osadzić nienaruszone komórki, podczas gdy fragmenty błony komórkowej pozostają na granicy faz.
Odrzucić supernatant. Ponownie zawieś komórki w pożywce wzrostowej i pokryj je płytką.
Czynniki wzrostu selektywnie promują proliferację nerwowych komórek macierzystych / progenitorowych i ich agregację w trójwymiarowe neurosfery.
Aby rozpocząć izolację nerwowych komórek macierzystych szczura, użyj mikronożyczek, aby zmielić wypreparowaną tkankę okołokomorową na kawałki o pojemności 1 milimetra sześciennego. Następnie przygotuj enzymatyczny bufor dysocjacyjny, dodając najpierw 5 mililitrów zbilansowanego roztworu soli Earla do fiolki z papainy z zestawu do dysocjacji papainy.
Umieścić fiolkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 minut, tak aby papaina całkowicie się rozpuściła, a roztwór wydawał się klarowny. Następnie dodaj 500 mikrolitrów zbilansowanego roztworu soli Earla do fiolki DNazy z zestawu dysocjacyjnego i delikatnie wymieszaj.
Dodać 250 mikrolitrów roztworu DNazy do fiolki zawierającej papainę i delikatnie wymieszać. Następnie dodaj zmieloną tkankę, około 0,2 grama, do fiolki i umieść fiolkę na platformie kołyskowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 45 minut do jednej godziny.
Po inkubacji rozcierać mieszaninę za pomocą 10-mililitrowej pipety, aby zdysocjować wszelkie pozostałe kawałki tkanki, aby uzyskać mętną zawiesinę komórek. Przenieś zawiesinę komórkową do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i odwiruj przy 300 g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
Podczas wirowania przygotuj roztwór ovomukoid, mieszając 2,7 mililitra zbilansowanego roztworu soli Earla z 300 mikrolitrami odtworzonego roztworu inhibitora albuminy w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów. Dodać 150 mikrolitrów uprzednio przygotowanego roztworu DNazy do roztworu ovomukoidu i wymieszać, odwracając probówkę.
Wyrzucić supernatant z granulowanych komórek i natychmiast ponownie zawiesić osad komórkowy w rozcieńczonej mieszaninie DNazy i inhibitora albuminy. Następnie przygotuj nieciągły gradient gęstości, dodając 5 mililitrów roztworu inhibitora albuminy do 15-mililitrowej probówki i za pomocą 5-mililitrowej pipety delikatnie i powoli ułóż zawiesinę komórkową na wierzchu roztworu inhibitora albuminy.
Odwirować próbkę o masie 70 g przez sześć minut w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy w 1 mililitrze wstępnie podgrzanej pożywki EFH dla szczurów, która jest przygotowana zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym.
Policz gęstość żywych komórek za pomocą hemocytometru i umieść komórki w kolbie hodowlanej T25 o gęstości 10 komórek na mikrolitr w EFH. Inkubuj kolby w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla i pozwól kulturom rosnąć bez zakłóceń przez tydzień, aby uniknąć agregacji kulek.