Przygotowanie jednokomórkowej zawiesiny komórek odpornościowych z mysiej tkanki mózgowej

Zacznij od mysiego mózgu z komórkami neuronalnymi, nieneuronalnymi i odpornościowymi w macierzy zewnątrzkomórkowej mózgu lub ECM.

Zmielić tkankę i ponownie zawiesić ją w pożywce hodowlanej.

Przenieś te fragmenty tkanek do probówki i potraktuj je kolagenazą i enzymami DNazy-I.

Kolagenaza trawi ECM, uwalniając pojedyncze komórki, podczas gdy DNaza-I degraduje wolne DNA, aby zapobiec zlepianiu się komórek.

Następnie dodaj EDTA, aby dezaktywować enzymy kolagenazy.

Dodaj pożywkę hodowlaną. Odwirować i usunąć supernatant.

Dodaj roztwór gradientu gęstości i pożywkę hodowlaną do osadu komórkowego, tworząc warstwę gradientu o niskiej gęstości.

Wymieszaj, a następnie pokryj roztwór roztworem gradientowym o dużej gęstości, aby ustalić różnicę gęstości.

Wirować z niską prędkością, aby oddzielić komórki odpornościowe na granicy faz, z lżejszymi szczątkami komórkowymi na górze i cięższymi komórkami neuronalnymi i glejowymi na dole.

Usuń górną warstwę, zbierz komórki odpornościowe i przenieś je do innej probówki.

Odwirować i usunąć supernatant, a następnie ponownie zawiesić komórki w pożywce, tworząc zawiesinę jednokomórkową do dalszych zastosowań.

Wlej tkankę mózgu lub rdzenia kręgowego z pożywką do 100-milimetrowej szalki Petriego i użyj kleszczy, aby przesunąć tkankę na dno. Zmiel tkankę mózgową sterylną żyletką i zbierz tkankę na dnie płytki. Dodać 3 mililitry RPMI uzupełnione 10% FCS do szalki Petriego, a następnie użyć 10-mililitrowej pipety serologicznej, aby ponownie zawiesić tkankę w pożywce i przenieść ją do 15-mililitrowej stożkowej probówki.

Dodaj kolagenazę typu I i DNazę I do tkanki i inkubuj probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 40 minut. Odwracaj probówki co 15 minut, aby dokładnie wymieszać tkankę z enzymami. Po inkubacji dodaj EDTA do każdej probówki, aby uzyskać końcowe stężenie 0,01 mola i inkubuj probówki przez dodatkowe pięć minut, aby dezaktywować kolagenazę.

Dodaj 9 mililitrów RPMI, uzupełnionych 10% FCS do każdej probówki, a następnie odwiruj probówki o masie 450 g przez 5 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Użyj pipety Pasteura z próżnią, aby zassać supernatant, uważając, aby nie dotknąć osadu komórkowego.

Dodaj 3 mililitry 100% roztworu gradientu gęstości izotonicznej do granulki komórek. Następnie dodaj dodatkowe media RPMI 10% FCS, aby doprowadzić końcową objętość do 10 mililitrów i ponownie zawiesić osad ogniwa. Odwróć i dobrze wymieszaj probówkę. Następnie włóż pipetę serologiczną z 1 mililitrem 70% roztworu gradientu gęstości izotonicznej o sile 70% na dno probówki.

Powoli podkładaj roztwór, uważając, aby nie zrobić pęcherzyków. Wyjmij pipetę serologiczną z probówki, uważając, aby nie naruszyć gradientu. Odwirować probówkę o masie 800 g przez 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, a następnie odessać supernatant, w tym warstwę resztek mieliny, aż w probówce pozostaną 2 do 3 mililitrów.

Użyj pipety o pojemności 1 mililitra, aby zebrać warstwę komórek między gradientem gęstości od 30% do 70% i przenieść ją do nowej 15-mililitrowej probówki. Dodaj pożywkę RPMI 10% FCS, aby doprowadzić końcową objętość do 15 mililitrów, a następnie odwiruj komórki w temperaturze 450 g przez 5 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.