Ustanowienie hodowli komórek glejowych Müllera uzyskanej z siatkówki myszy

Weźmy na przykład siatkówki myszy zawierające komórki glejowe Müllera lub MG i neurony.

Umieść je w roztworze dysocjacyjnym z enzymami trawiennymi i inkubuj z delikatnym kołysaniem, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie enzymów.

Enzymy te rozkładają macierz zewnątrzkomórkową, odrywając poszczególne komórki.

Kilkakrotnie pipetuj siatkówki w górę i w dół, aby uwolnić komórki.

Dodaj inhibitor, aby zatrzymać aktywność enzymu, a następnie odwiruj.

Odrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić komórki w pożywce zawierającej czynnik wzrostu specyficzny dla komórek MG.

Przenieś komórki do studzienki i inkubuj.

Z biegiem czasu czynnik wzrostu w pożywce ułatwia wzrost i namnażanie komórek MG, podczas gdy niedzielące się komórki neuronalne giną.

Wyjmij nośnik. Umyć buforem solnym.

Inkubuj z enzymem trawiennym, aby odłączyć komórki od studzienki.

Zbierz komórki w probówce, a następnie odwiruj.

Odrzucić supernatant zawierający martwe komórki nerwowe.

Ponownie zawiesić komórki MG w pożywce w celu dalszej analizy.

Przygotować mieszaninę dysocjacyjną papainy DNazy I zgodnie z opisem w manuskrypcie. Teraz, za pomocą pipety transferowej z powiększoną końcówką, podnieś siatkówki. Poczekaj, aż siatkówki osiądą na dnie końcówki i uwolnij siatkówki, bez nadmiernego HBSS, do probówki zawierającej mieszaninę papainy DNazy I.

Następnie umieść probówkę na nutatorze w inkubatorze i inkubuj przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i z 5% dwutlenkiem węgla. Następnie oddziel komórki, ostrożnie pipetując w górę iw dół za pomocą pipety o pojemności 1 mililitra. Po dysocjacji komórek dodaj 275 mikrolitrów inhibitora proteazy owomkoidalnej z zestawu do dysocjacji papainy, aby zneutralizować papainę i delikatnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół.

Umieść probówki w wirówce i wiruj w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 8 minut przy względnej sile odśrodkowej 300. Dodaj naskórkowy czynnik wzrostu do obliczonej objętości pożywki podgrzanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Ostrożnie wyjmij probówki z wirówki.

Nie dotykając osadu znajdującego się na dnie probówki, usunąć supernatant ostrożnie i całkowicie. Teraz ponownie zasymij osad komórkowy za pomocą 500 mikrolitrów pożywki wzrostowej uzupełnionej naskórkowym czynnikiem wzrostu. Następnie przenieś zawiesinę komórek do jednego dołka na oznakowanej płytce 12-dołkowej. Przepłucz probówkę kolejnymi 500 mikrolitrami pożywki wzrostowej uzupełnionej naskórkowym czynnikiem wzrostu i dodaj ją do studzienki.

Ostrożnie kołysz płytą studzienki. Następnie umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z dwutlenkiem węgla. Zacznij od sprawdzenia zbieżności komórek od 90% do 100%. Następnie usuń pożywkę i dodaj 1 mililitr zimnego HBSS, aby umyć studnię. Delikatnie kołysz płytką i usuń HBSS bez pozostawiania śladów.

Później dodaj 500 mikrolitrów podgrzanego roztworu zawierającego trypsynę, aby odłączyć komórki od studzienki. Delikatnie kołysz i inkubuj przez 2 minuty w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po przeniesieniu płytki z inkubatora do komory bezpieczeństwa biologicznego, należy zassać roztwór zawierający trypsynę, przechylając. Kilkakrotnie rozprowadź go ostrożnie i powoli w studzience, aż komórki całkowicie się oderwą.

Następnie przenieś tę zawiesinę komórek do sterylnej probówki o pojemności 1,5 mililitra i włóż probówki do wirówki. Wirować 300 razy g przez 8 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza i włożyć probówki z powrotem do komory bezpieczeństwa biologicznego. Usunąć sklarowany osad bez dotykania osadu. Teraz ostrożnie ponownie zawiesić osad komórkowy, dodając 600 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej i pipetując w górę iw dół około 30 do 40 razy.