Name: Litografia plazmowa Modelowanie powierzchni do tworzenia sieci komórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Poznaj litografię plazmową do tworzenia mikrośrodowisk komórkowych na powierzchniach wzorcowanych. Ta metoda umożliwia badanie zachowań komórek nerwowych i mięśniowych w kontrolowanych warunkach in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy D. D. Zhang za wnikliwe dyskusje i hojne udostępnienie odczynników. M. J. otrzymuje wsparcie z NIH Cardiovascular Training Grant, Arizona Technology Research Initiative Fund oraz Achievement Rewards for College Scientists. Praca ta jest finansowana przez NIH Director's New Innovator Award (1DP2OD007161-01), National Science Foundation (0855890) oraz James S. McDonnell Foundation.

1. Tworzenie form wykorzystywanych do wzorcowania
<ol>
<li>Projekt koncepcyjny wzorów. Tworzone są wzory, które służą do formowania sieci komórkowych, kontrolowania kontaktu między komórkami, izolowania komórek, naśladowania struktur naturalnych lub w inny sposób kierowania adhezją i rozmieszczeniem komórek.</li>
<li>Tworzenie wzoru i fotomaski w oparciu o projekt wspomagany komputerowo (CAD). Pożądany wzór jest projektowany w oprogramowaniu CAD, takim jak AutoCAD, a następnie wysyłany do zewnętrznej firmy w celu wykonania fotomaski.</li>
<li>Fotolitografia w celu wytworzenia wzorca głównego. Płytki szklane są wzorowane przy użyciu cienkiego resistu pozytywowego lub grubego resistu negatywowego, w zależności od rozmiaru tworzonej struktury. Płytki szklane stosuje się ze względu na niski koszt, większą wytrzymałość niż w przypadku wafli krzemowych oraz mniejszą ilość pyłu powstającego przy ich stłuczeniu. Alternatywnie, jako wzorzec główny można wykorzystać inne odpowiednie struktury, takie jak siatki dyfrakcyjne.</li>
<li>Wzorowana płytka zostaje przytwierdzona do stosu płytek, które nie zostały wzorowane. Wszystkie kroki są wykonywane wewnątrz kaptura z laminarnym przepływem powietrza, aby zminimalizować ilość kurzu.</li>
<li>Tworzenie form głównych. Tworzony jest pojemnik z folii aluminiowej, nieco większy niż stos płytek, aby pomieścić 30 g polidimetylosiloksanu (PDMS), który następnie jest wlewany na powierzchnię wzorowaną fotolitograficznie w celu stworzenia wstępnej formy. PDMS jest odgazowany i pozostawiony do utwardzenia przez jeden do dwóch dni.</li>
<li>Po utwardzeniu PDMS jest odrywany od wzorca głównego i tworzy formę do kolejnego etapu.</li>
<li>Mieszany przez 1 minutę 6 g dwuskładnikowej żywicy epoksydowej (Devcon #14310(6 g)), a następnie wlewa się ją do formy głównej, odgazowuje i pozostawia do utwardzenia. Odgazowywanie żywicy epoksydowej musi być przeprowadzone szybko (&lt;8 min) przy użyciu wielu cykli usuwania pęcherzyków powietrza i przy zastosowaniu jedynie cienkiej warstwy, zanim żywica stężeje i usunięcie pęcherzyków stanie się niemożliwe. Użycie 6 g pozwala na uzyskanie cienkiej warstwy, co ułatwia szybkie usuwanie pęcherzyków.</li>
<li>Po godzinie żywica epoksydowa będzie częściowo utwardzona i na wierzch można dodać więcej żywicy bez odgazowywania, aby uzyskać grubszą strukturę, która jest łatwiejsza w obsłudze w późniejszych krokach. Żywica jest następnie pozostawiona do utwardzenia przez jeden do dwóch dni.</li>
<li>Po utwardzeniu żywica epoksydowa jest usuwana z głównej formy PDMS, a wokół formy epoksydowej owija się taśmę, aby stworzyć pojemnik. Następnie tworzy się formę roboczą poprzez wlanie PDMS na formę epoksydową, odgazowanie PDMS i utwardzanie przez jeden do dwóch dni.</li>
<li>Po utwardzeniu forma robocza jest odrywana od żywicy epoksydowej i przechowywana w celu zachowania czystości.</li>
</ol>
2. Wzorcowanie powierzchni za pomocą form do prowadzenia komórek
<ol>
<li>Wycinane są niewielkie fragmenty formy roboczej i umieszczane na polistyrenowej szalce Petriego. Pozycje tych fragmentów formy zostają oznakowane.</li>
<li>Z niewielkich fragmentów tworzy się statyw, który następnie obciążone, aby zapewnić przyleganie formy roboczej do powierzchni szalki Petriego. Prawidłowe rozmieszczenie można zweryfikować, patrząc na dno szalki.</li>
<li>Zestaw zostaje umieszczony w komorze plazmowej. Rozpoczyna się i kontynuuje proces traktowania plazmą powietrzną przy ciśnieniu 150 Pa i mocy 29,6 W (moc maksymalna) przez 10 minut.</li>
<li>Po traktowaniu plazmą wyjmuje się formę wraz z obciążnikami.</li>
<li>Szalkę Petriego umieszcza się pod światłem UV w komorze bezpiecznej dla biologii na 10 minut w celu sterylizacji, a następnie przechowuje w niej do czasu zasiewu komórek.</li>
</ol>
3. Wysiewanie komórek na powierzchnie
<ol>
<li>Komórki neuroblastoma ludzkiego SH-SY5Y CRL-226 lub inne linie komórkowe są hodowane zgodnie ze standardowymi protokołami dla danego typu komórek.</li>
<li>Przed wysianiem na wzorzec naniesiony na powierzchnię, stopień konfluencji komórek neuroblastoma ludzkiego SH-SY5Y CRL-26 jest oceniany wizualnie.</li>
<li>Przeprowadzane jest standardowe pasażowanie w celu odzyskania komórek z powierzchni szalki Petriego.</li>
<li>Komórki po uwolnieniu do zawiesiny są rozcieńczane w celu uzyskania pożądanej konfluencji po wysianiu na powierzchnię szalki Petriego z naniesionym wzorcem.</li>
<li>Komórki pozostawia się do czasu ich osiadania i przytwierdzenia do powierzchni.</li>
<li>Szalkę Petriego z naniesionym wzorcem inkubuje się od kilku godzin do kilku dni, podczas gdy komórki organizują się zgodnie ze wzorcem stworzonym przez plazmę.</li>
<li>Podczas hodowli komórek neuroblastoma codziennie dodaje się kwas retinowy (10 μM) w celu indukcji różnicowania komórek do stanu neuronopodobnego. Dodawanie kwasu retinowego odbywa się w ciemności.</li>
<li>Kwas retinowy jest dodawany codziennie przez kilka dni, po czym widoczne staje się różnicowanie.</li>
<li>Pożywkę wymienia się co 3-4 dni.</li>
</ol>
4. Obserwacja i analiza
<ol>
<li>Wykonuje się okresowe obrazy lub nagrania wideo żywych komórek, aby obserwować ich zachowanie w czasie. W przypadku obrazowania żywych komórek, są one umieszczone w inkubatorze na stoliku mikroskopu, który utrzymuje temperaturę 37 °C, 10% wilgotności oraz 5% CO2. Komórki mogą być również utrwalane i barwione w celu obserwacji w fluorescencji</li>
<li>Przechwycone obrazy lub nagrania wideo komórek są importowane do systemu analizy obrazu, a następnie wykonuje się pomiary, w tym szybkość wzrostu, wielkość komórek, prędkość migracji, różnicowanie, orientację, lokalizację specyficznych białek i inne parametry.</li>
</ol>

5. Reprezentatywne wyniki:
Typowym wynikiem zastosowania techniki litografii plazmowej jest utworzenie wzoru komórek przypominającego dowolną lub naturalną strukturę. Przedstawiono to na Rysunku 1a-b, gdzie stworzono linie i sieci neuronów. Można wykorzystać również inne typy komórek, co pokazano na Rysunku 1c-d, gdzie ludzkie komórki śródbłonka żyły pępkowej (HUVEC) oraz komórki mięśni szkieletowych C2C12 tworzą siatki. Można również tworzyć wzory z materiałów takich jak poli-l-lizyna, Rysunek 1e, aby ułatwić przyleganie określonych typów komórek lub w innych celach. W przypadku przedstawionych neuronów stworzono sieci komórek posiadających wzajemne połączenia. Odzwierciedla to procesy zachodzące naturalnie w mózgu, gdzie neurony mają dyskretne połączenia między sąsiadującymi komórkami, co wpływa na funkcjonowanie mózgu. Dzięki stworzeniu takiej struktury w laboratorium można systematycznie kontrolować liczbę, położenie, częstotliwość oraz inne czynniki dotyczące tych połączeń. Wyniki takich układów można ocenić wizualnie, a w celu zbadania zachowania sieci można zastosować dodatkowe bodźce, takie jak stymulacja chemiczna lub elektryczna.
Wynikiem negatywnym byłby wzór przerośnięty lub niekompletny bądź zanieczyszczona próbka. Niekompletny lub przerośnięty wzór byłby wynikiem wysiania na podłożu zbyt małej lub zbyt dużej liczby komórek, co nie zapewniłoby wzorowi optymalnej gęstości komórek. Ponadto, jeśli wzór nie zostanie zaprojektowany prawidłowo (np. linie będą zbyt wąskie), komórki nie będą w stanie skutecznie do niego przywrzeć i rosnąć. W przypadku zanieczyszczonej próbki oznaczałoby to brak zachowania odpowiedniej czystości podczas jednego z etapów, choć zdarza się to rzadko przy stosowaniu właściwych protokołów hodowli komórkowych, ponieważ wzorowanie plazmą sterylizuje również podłoże.
<img src="/files/ftp_upload/3115/3115fig1.jpg" alt="Tworzenie wzorców komórkowych pod mikroskopem; wizualizacja procesów; analiza optyczna w mikrofluidyce." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1. Wzorowanie komórek i białek.

<ol><li>Junkin, M., Watson, J., Vande Geest, J. P., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template-Guided+Self-Assembly+of+Colloidal+Quantum+Dots+Using+Plasma+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Template-Guided Self-Assembly of Colloidal Quantum Dots Using Plasma Lithography.</a> Adv Mater. 21, 1247-1251 (2009).</li>
<li>Junkin, M., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cell+migration+in+confined+environments+by+plasma+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Probing cell migration in confined environments by plasma lithography.</a> Biomaterials. 32, 1848-1855 (2011).</li>
<li>Keyes, J., Junkin, M., Cappello, J., Wu, X., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaporation-induced+assembly+of+biomimetic+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+Lett%22%5BJournal%5D)">Evaporation-induced assembly of biomimetic polypeptides.</a> Appl Phys Lett. 93, 023120-023 (2008).</li>
<li>Langowski, B. A., Uhrich, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+Plasma-Initiated+Patterning+%28%CE%BCPIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Microscale Plasma-Initiated Patterning (μPIP).</a> Langmuir. 21, 10509-10514 (2005).</li>
<li>Tourovskaia, A., Barber, T., Wickes, B. T., Hirdes, D., Grin, B., Castner, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterns+of+Chemisorbed+Cell+Adhesion-Repellent+Films+Using+Oxygen+Plasma+Etching+and+Elastomeric+Masks%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Micropatterns of Chemisorbed Cell Adhesion-Repellent Films Using Oxygen Plasma Etching and Elastomeric Masks.</a> Langmuir. 19, 4754-4764 (2003).</li>
<li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+Control+of+Cell+Life+and+Death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Geometric Control of Cell Life and Death.</a> Science. 276, 1425-1428 (1997).</li>
<li>Johansson, B. -L., Larsson, A., Ocklind, A., Ohrlund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Air+Plasma-Treated+Polymer+Surfaces+by+ESCA+and+Contact+Angle+Measurements+for+Optimization+of+Surface+Stability+and+Cell+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of Air Plasma-Treated Polymer Surfaces by ESCA and Contact Angle Measurements for Optimization of Surface Stability and Cell Growth.</a> Journal of Applied Polymer Science. 86, 26185-26185 (2002).</li>
<li>Murakami, T., Kuroda, S. -i, Osawa, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Polymeric+Solid+Surfaces+Treated+with+Oxygen+Plasma%3A+Effect+of+Aging+Media+after+Plasma+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Polymeric Solid Surfaces Treated with Oxygen Plasma: Effect of Aging Media after Plasma Treatment.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 202, 37-44 (1998).</li>
<li>Strobel, M., Lyons, C. S., Mittal, K. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStrobel%2C+M+%22Plasma+surface+modification+of+polymers%3A+Relevance+to+adhesion%22">Plasma surface modification of polymers: Relevance to adhesion</a>. , VSP. Utrecht, Netherlands. (1994).</li>
<li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Materials+Science%22%5BJournal%5D)">Soft Lithography.</a> Annual Review of Materials Science. 37, 550-575 (1998).</li>
<li>Song, M., Uhrich, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+Micropattern+Dimensions+Enhance+Neurite+Outgrowth+Rates%2C+Lengths%2C+and+Orientations%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Optimal Micropattern Dimensions Enhance Neurite Outgrowth Rates, Lengths, and Orientations.</a> Annals of Biomedical Engineering. 35, 1812-1820 (2007).</li>
<li>Zhao, F., Wu, T., Lau, A., Jiang, T., Huang, Z., Wang, X. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2+promotes+neuronal+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nrf2 promotes neuronal cell differentiation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 47, 867-879 (2009).</li>
<li>Ohl, A., Schroder, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma-induced+chemical+micropatterning+for+cell+culturing+applications%3A+a+brief+review%5BTitle%5D)+AND+%22Surface+and+Coatings+Technology%22%5BJournal%5D)">Plasma-induced chemical micropatterning for cell culturing applications: a brief review.</a> Surface and Coatings Technology. 116-119, 820-830 (1999).</li>
<li>van Kooten, T. G., Spijker, H. T., Busscher, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma-treated+polystyrene+surfaces%3A+model+surfaces+for+studying+cell-biomaterial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Plasma-treated polystyrene surfaces: model surfaces for studying cell-biomaterial interactions.</a> Biomaterials. 25, 1735-1747 (2004).</li>
<li>Loesberg, W. A., te Riet, J., van Delft, F., Schön, P., Figdor, C. G., Speller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+threshold+at+which+substrate+nanogroove+dimensions+may+influence+fibroblast+alignment+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The threshold at which substrate nanogroove dimensions may influence fibroblast alignment and adhesion.</a> Biomaterials. 28, 3944-3951 (2007).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiona tutaj metoda badania komórek umożliwia tworzenie złożonych wzorów wielokomórkowych sieci naśladujących struktury biologiczne, a także dostarcza sposobu generowania bodźców o charakterze subkomórkowym, co ułatwia badania zachowania grup komórek oraz odpowiedzi pojedynczych komórek na czynniki środowiskowe. Zastosowanie tej metody jest proste, a zarazem niezawodne, ponieważ można ją szybko przeprowadzić przy użyciu niedrogiego sprzętu w tym samym laboratorium, w którym prowadzona jest hodowla komórkowa. Metoda ta wykazuje również wysoką wrażliwość komórkową, pozwala na łatwą obserwację wynikowego zachowania i jest z natury stabilna przez długi czas, co umożliwia badanie długoterminowego zachowania komórek. Dodatkowo pozwala ona na przeprowadzenie szerokiego zakresu eksperymentów, ponieważ jest kompatybilna z wieloma typami komórek i umożliwia tworzenie dowolnych wzorów. Długoterminowa stabilność tej techniki wynika z faktu, że funkcjonalizacja powierzchni nadana przez plazmę jest integralną częścią powierzchni, a nie powłoką lub inną warstwą, która mogłaby zostać usunięta lub ulec degradacji. W warunkach zanurzenia w cieczy tego typu modyfikacja może zachować zdolność kierowania komórkami przez wiele miesięcy.
Najbardziej krytyczną częścią eksperymentu, niezbędną do zapewnienia wiarygodnych wyników, jest stworzenie wzorca głównego, który zostanie ostatecznie wykorzystany do kierowania wzrostem komórek. Jeśli wzorzec ten nie zostanie odpowiednio zaprojektowany, komórki nie zareagują na niego w prawidłowy sposób i mogą nie wykazać pożądanej aktywności. Parametry takie jak szerokość linii, odstępy między elementami wzoru i inne mogą w znacznym stopniu wpływać na kompatybilność komórek z konkretnym wzorcem; zazwyczaj na początkowej fotomase tworzy się zakres takich parametrów, aby wyłonić najbardziej odpowiedni projekt.
Inne ważne parametry związane z wykonywaniem wzorowania obejmują tworzenie formy, utrzymanie środowiska wolnego od pyłu, wysiew komórek oraz ogólną sterylność hodowli komórkowej. Tworzenie formy może być realizowane poprzez różne etapy przenoszenia, które przeprowadza się, aby umożliwić wielokrotne odlewanie PDMS z formy epoksydowej. Formę epoksydową tworzy się dlatego, że nie ulega ona takiej degradacji jak forma z fotorezystu z małymi strukturami o wysokim współczynniku kształtu podczas wielokrotnego odlewania. Jeśli formowanie transferowe zostanie wykonane prawidłowo, wymiary i wydajność nie zostaną zmienione, natomiast w przypadku błędów, takich jak niewłaściwe odgazowanie, niepełne utwardzanie lub nadmierne nagrzewanie, mogą pojawić się pęcherzyki, chropowatość i deformacja wzoru, co wpływa na końcowy rezultat. W odniesieniu do utrzymania środowiska wolnego od pyłu, formy muszą być utrzymywane w jak największej czystości, ponieważ każdy pył może zakłócić prawidłowy kontakt między roboczą formą PDMS a powierzchnią, a tym samym prawidłowe ekranowanie plazmą i wzorowanie chemiczne. Gęstość wysiewu komórek również musi być zoptymalizowana, aby zapewnić, że w obszarze wzoru nie znajdzie się zbyt mało ani zbyt wiele komórek, a sterylność musi być zachowana, aby uniknąć zanieczyszczenia bakteriami i innymi czynnikami komórek wykorzystywanych w badaniu.
Technikę tę można również połączyć z innymi elementami, takimi jak mikroprzepływy, mikroelektrody i sondy mechaniczne. Pozwala to na dostarczenie komórkom dodatkowych bodźców w celu lepszego odwzorowania różnych warunków fizjologicznych podczas eksperymentów, a przyszłe prace skupią się na badaniu efektów tych kombinacji

<table><tbody><tr><td>Oczyszczacz plazmowy i komora próżniowa</td><td>Harrick Scientific Products, Inc.</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop fluorescencyjny i fazowo-kontrastowy</td><td>Instrumenty Nikon</td><td>TE2000-U</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator na stolik mikroskopu</td><td>AmScope</td><td>Model TCS-100</td><td>Zmodyfikowany w celu dołączenia komory zapewniającej odpowiednią atmosferę</td></tr><tr><td>szalka Petri z polistyrenu</td><td>VWR international</td><td>25384-090</td><td></td></tr><tr><td>Polidimetylosiloksan (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Żywica epoksydowa</td><td>Devcon Inc.</td><td>2 t przejrzysta żywica epoksydowa #14310</td><td></td></tr><tr><td>Pożywki do hodowli komórkowych</td><td>Różnorodne</td><td></td><td>Pożywki są sporządzane zgodnie ze standardowymi recepturami dla danego typu komórek</td></tr><tr><td>Kwas retinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr></tbody></table>

wzornictwo powierzchni metodą litografii plazmowej do tworzenia sieci komórkowych

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematyczna manipulacja mikrośrodowiskiem komórkowym z rozdzielczością mikro- i nanometryczną jest często niezbędna do wyjaśnienia różnych zjawisk komórkowych i molekularnych. Aby sprostać temu wymaganiu, opracowaliśmy technikę litografii plazmowej do manipulowania mikrośrodowiskiem komórkowym poprzez tworzenie powierzchni z wzorem o rozmiarach elementów od 100 nm do milimetrów. Celem tej techniki jest możliwość kontrolowanego badania zachowań pojedynczych komórek, jak również grup komórek oraz ich interakcji.
Ta metoda litografii plazmowej opiera się na selektywnej modyfikacji chemii powierzchni podłoża poprzez osłanianie kontaktu plazmy niskotemperaturowej za pomocą fizycznej formy. Takie selektywne osłanianie pozostawia wzór chemiczny, który może kierować przyleganiem i ruchem komórek. Wzór ten, czyli szablon powierzchniowy, może być następnie wykorzystany do tworzenia sieci komórek, których struktura może naśladować tę występującą w naturze, tworząc kontrolowane środowisko do badań eksperymentalnych. Technika ta dobrze nadaje się do badania zjawisk biologicznych, ponieważ w sposób biokompatybilny wytwarza stabilne wzory powierzchniowe na przezroczystych podłożach polimerowych. Wzory powierzchniowe utrzymują się od tygodni do miesięcy, dzięki czemu mogą kierować interakcjami z komórkami przez długi czas, co ułatwia badanie długoterminowych procesów komórkowych, takich jak różnicowanie i adaptacja. Modyfikacja powierzchni ma charakter przede wszystkim chemiczny, zatem nie wprowadza interferencji topograficznych ani fizycznych, które mogłyby zakłócić interpretację wyników. Proces tworzenia wzorów nie wymaga również stosowania agresywnych lub toksycznych substancji i jest kompatybilny z hodowlą tkanek. Co więcej, metodę tę można zastosować do modyfikacji różnych typów podłoży polimerowych, które dzięki możliwości dostrajania ich właściwości są idealne i szeroko stosowane w aplikacjach biologicznych. Osiągalna rozdzielczość jest również korzystna, ponieważ izolacja konkretnych procesów, takich jak migracja, adhezja czy wiązanie, pozwala na dyskretne i przejrzyste obserwacje na poziomie pojedynczych oraz wielu komórek.
Metoda ta była stosowana do tworzenia zróżnicowanych sieci różnych typów komórek w badaniach dotyczących migracji, sygnalizacji, formowania tkanek oraz zachowania i interakcji neuronów ułożonych w sieć.

Opracowano wszechstronną technikę litografii plazmowej do tworzenia stabilnych wzorów powierzchniowych służących do kierowania adhezją komórkową. Technika ta może być stosowana do tworzenia sieci komórkowych, w tym takich, które naśladują naturalne tkanki, i była wykorzystywana do badania kilku odrębnych typów komórek.

Wzornictwo powierzchni metodą litografii plazmowej do tworzenia sieci komórkowych

Systematyczna manipulacja mikrośrodowiskiem komórkowym z rozdzielczością mikro- i nanometryczną jest często niezbędna do rozszyfrowania różnych procesów komórkowych i molekularnych ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest stworzenie mikrośrodowisk komórkowych w celu zbadania zagadnień biologicznych związanych z zachowaniem pojedynczych komórek oraz grup komórek, które zachodzą w wymiarach mikro- i nanometrycznych. Osiąga się to najpierw poprzez zaprojektowanie szablonów, które ostatecznie będą kierować rozmieszczeniem komórek. Następnie projekty te są przenoszone na powierzchnie wzorowane za pomocą fotolitografii, co umożliwia stworzenie form do ekranowania plazmą przy użyciu soft litografii.Na koniec formy ekranujące układa się w kształcie statywu w szalce Petriego, aby umożliwić selektywną ekspozycję powierzchni podłoża na plazmę, co pozwoli na utworzenie chemicznego wzoru wrażliwego na komórki w obszarach znajdujących się pod każdą formą. Uzyskane wyniki mogą wykazać, w jaki sposób zachowanie komórki zależy od jej mikrośrodowiska oraz oddziaływań z sąsiednimi komórkami. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące wpływu mikrośrodowisk na zachowanie komórek, na przykład w kwestii tego, jak interakcje między grupami komórek wpływają na zjawiska wyższego rzędu.A w jaki sposób podkomórkowe sygnały w skali nanometrycznej wpływają na takie funkcje jak migracja i różnicowanie komórek? Najpierw należy użyć kleju super glue, aby przymocować szkiełko z wzorem do stosu pustych szkiełek. Następnie należy przygotować z folii aluminiowej pojemnik nieco większy niż stos szkiełek i wystarczająco duży, aby pomieścić 30 gramów polidimetylosiloksanu lub PDMS.Umieść stos szkiełek w pojemniku, a następnie wlej PDMS nad stos szkiełek, aby utworzyć wstępną formę. Następnie odgazuj PDMS, umieszczając pojemnik w komorze próżniowej. Usuń pęcherzyki powietrza obecne w PDMS, kilkakrotnie szybko zdejmując i nakładając palec na rurkę zaworu wlotowego, aby na krótko dopuścić przepływ powietrza do komory.Zawór pozostaje zamknięty przez pięć minut nieprzerwanego odgazowywania. Następnie należy pozostawić PDMS do utwardzenia w czystej komorze z przepływem laminarnym w temperaturze pokojowej przez jeden do dwóch dni. Po utwardzeniu PDMS odrywa się od matrycy wzorcowej, tworząc formę.Następnie do formy głównej wlej cienką warstwę sześciu gramów dwuskładnikowej żywicy epoksydowej, którą właśnie mieszano przez jedną minutę. Bezzwłocznie odgazuj żywicę, stosując wielokrotne cykle usuwania pęcherzyków powietrza, zanim żywica stężeje. Po pozostawieniu odgazowanej żywicy w spokoju przez godzinę, zostanie ona częściowo utwardzona.Dodaj do formy więcej żywicy epoksydowej bez odgazowywania, aby uzyskać grubszą strukturę, którą łatwiej będzie manipulować w kolejnych etapach. Następnie pozostaw żywicę do utwardzenia na jeden do dwóch dni. Po utwardzeniu formy epoksydowej wyjmij ją z matrycy PDMS, a następnie owiń formę epoksydową taśmą, aby utworzyć pojemnik.Następnie można stworzyć formę roboczą, wlewając PDMS na formę epoksydową, odgazowując PDMS i utwardzając nową formę przez jeden do dwóch dni. Po utwardzeniu formy roboczej należy oddzielić ją od epoksydu, a następnie przechowywać obie formy w szalkach Petriego w szczelnym plastikowym pojemniku wewnątrz dygestorium, aby zachować czystość. Aby przygotować formę do strukturyzowania powierzchni, należy wyciąć żyletką małe fragmenty formy roboczej i umieścić je w szalce Petriego.Położenia tych sekcji formy należy oznaczyć na spodniej stronie szalki Petriego permanentnym markerem, obrysowując miejsca, w których znajdują się sekcje formy; należy utworzyć z sekcji statyw i odczekać, aż statyw zapewni konformalny kontakt między formą roboczą a powierzchnią szalki Petriego. Należy spojrzeć na dno szalki, aby potwierdzić prawidłowe rozmieszczenie, co potwierdza obecność kanałów widocznych gołym okiem lub za pomocą małej soczewki powiększającej. Następnie cały zespół należy umieścić w komorze plazmowej.Rozpocząć obróbkę plazmą po zakończeniu procedury obróbki plazmowej. Usunąć formę i układ obciążników, a następnie umieścić szalkę Petriego w komorze z laminarnym przepływem powietrza pod światłem UV na 10 minut w celu sterylizacji. Przechowywać szalkę w tym miejscu do momentu zasiewu komórek.Rozcieńczyć wybrane komórki eksperymentalne w standardowej pożywce hodowlanej, aby uzyskać pożądany stopień konfluencji. Po umieszczeniu na wzorowanej powierzchni szalki Petriego, nalać do niej 3 mL zawiesiny komórkowej. Inkubować wzorowaną szalkę Petriego w temperaturze 37 °C, przy 5% carbon dioxide i 100% humidity przez okres od kilku godzin do kilku dni, aby umożliwić komórkom zgromadzenie się w wzorze utworzonym przez plazmę.Wzorcowanie jest sprawdzane za pomocą mikroskopii kontrastowej. Podczas hodowli komórek neuroblastoma codziennie dodaje się 10 µM kwasu retinowego, aż do momentu zaobserwowania różnicowania komórek do stanu przypominającego neurony. Standardową pożywkę do hodowli komórkowej należy wymieniać co trzy do czterech dni.Typowym wynikiem zastosowania techniki litografii plazmowej jest utworzenie wzoru komórek przypominającego określoną strukturę sztuczną lub naturalną. Przykład można zobaczyć na tej rysunku, przedstawiającym neurony zróżnicowane za pomocą kwasu retinowego na wzorze linii. Tutaj, na tym rysunku, przedstawiono stworzone linie i sieci neuronów; do tego celu można wykorzystać również inne typy komórek, co widać na dwóch kolejnych rysunkach – ten rysunek pokazuje ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej, a ten rysunek przedstawia komórki mięśni szkieletowych C2C12 tworzące widoczne tutaj siatki.Materiały takie jak polilizyna mogą być również nakładane w formie wzorów, aby ułatwić przywieranie określonych typów komórek oraz do innych zastosowań. Po wykonaniu tej procedury można wprowadzić dodatkowe elementy, takie jak mikrofluidyka, sondowanie komórek lub manipulacje genetyczne specyficznych białek, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. jak kombinacje bodźców wpływają na zachowanie komórek w skali indywidualnej oraz w strukturach wyższego rzędu?

plasma-lithography-surface-patterning-for-creation-of-cell-networks

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Wzorcowanie powierzchni litografią plazmową w celu stworzenia sieci komórkowych

Drukowanie mikrokontaktowe jest szeroko stosowane do wzorowania białek i innych cząsteczek na powierzchniach materiałów. Demonstrujemy podstawowe kroki tego procesu, polegające na stemplowaniu wzorów fibronektyny na szkle.

Mikrodruk białek w biologii komórki

Samoorganizujące się monowarstwy (SAMs) utworzone z długołańcuchowych alkanotioli na złocie stanowią precyzyjnie zdefiniowane podłoża do tworzenia wzorów białkowych oraz ograniczania przestrzeni wzrostu komórek. Mikro kontaktowy druk heksadekanotiolu przy użyciu stempla z polidimetylosiloksanu (PDMS), a następnie wypełnienie wolnych przestrzeni monomerem alkanotiolu zakończonym grupą glikolową, pozwala na uzyskanie wzoru, w którym białka i komórki adsorbują wyłącznie do obszaru z nadrukowanym...

Tworzenie dwuwymiarowych wzorowanych podłoży do ograniczania przestrzeni białek i komórek

W tym protokole demonstrujemy wytwarzanie biomimetycznych substratów do hodowli komórek serca wykonanych z dwóch różnych materiałów polimerowych za pomocą litografii kapilarnej.  Opisane metody zapewniają skalowalną, opłacalną technikę inżynierii struktury i funkcji makroskopowych tkanek serca do zastosowań in vitro i in vivo.

Litografia sił kapilarnych w inżynierii tkankowej serca

Ten protokół opisuje metodę tworzenia wzorów komórkowych na SiO2 kompatybilną z mikrofabrykacją. Predefiniowany wzór parylenu-C jest drukowany fotolitograficznie na płytkach SiO2. Po inkubacji z surowicą (lub innym roztworem aktywacyjnym) komórki przylegają specyficznie (i rosną zgodnie z zgodnością) leżącego poniżej parylenu-C, będąc jednocześnie odpychane przez regiony SiO2.

Wzorcowanie komórek na zdefiniowanych fotolitograficznie 
Parylene-C: Substraty SiO2

Opisane są protokoły dla układu mikroprzepływowego pojedynczego neuronu i maskowania wody dla wbudowanego w układ plazmowy wzór powłok biomateriałowych. Wysoce powiązane ze sobą kokultury można przygotować przy użyciu minimalnego wkładu komórek.

Przygotowanie kokultur neuronalnych z precyzją pojedynczej komórki

Ten protokół opisuje metodologię biodruku przy użyciu zautomatyzowanego zrobotyzowanego systemu deponowania, który łączy wytrawione wskazówki topograficzne z precyzyjnym osadzaniem biotuszu z hydrożelu na komórce. Wydrukowane komórki są dostarczane bezpośrednio do wytrawionych elementów i są w stanie je wyczuć i zorientować się w sytuacji.

Zautomatyzowana zrobotyzowana technika dozowania do prowadzenia powierzchni i biodruku komórek

Przedstawiono protokół wytwarzania dużego obszaru nanowzorzystego podłoża z małych form o nanowzorze do badania nanotopograficznej modulacji zachowania komórek.

Ekspandowanie nanowzorzystych substratów przy użyciu techniki ściegu do nanotopograficznej modulacji zachowania komórek

Ten raport opisuje prostą, łatwą do wykonania technikę, wykorzystującą próżnię niskociśnieniową, do wypełniania kanałów mikroprzepływowych komórkami i substratami do badań biologicznych.

Wszechstronna metoda modelowania białek i komórek

Ten protokół wprowadza metodę mikrowzorowania bez litografii, która jest prosta i dostępna dla osób z ograniczonym doświadczeniem w bioinżynierii. Metoda ta wykorzystuje spersonalizowane, wycinane laserowo szablony do mikromodelowania białek macierzy zewnątrzkomórkowej w kształcie interesującym do modulowania morfologii komórek. Procedura mikrowzorcowania została zademonstrowana przy użyciu indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych.

Proste, wolne od litografii mikromodelowanie pojedynczych komórek przy użyciu szablonów wycinanych laserowo

Przedstawiony tutaj protokół umożliwia zautomatyzowane wytwarzanie mikrowzorów, które standaryzują kształt komórki, do badania struktur cytoszkieletu w komórkach ssaków. Ta przyjazna dla użytkownika technika może być skonfigurowana z dostępnymi na rynku systemami obrazowania i nie wymaga specjalistycznego sprzętu niedostępnego dla standardowych laboratoriów biologii komórki.

Kontrola geometrii komórki za pomocą mikromodelowania wspomaganego laserem w podczerwieni

Tradycyjnie, hodowla komórkowa jest przeprowadzana na płaskich podłożach, które słabo naśladują naturalne środowisko komórek in vivo. W tym miejscu opisujemy metodę wytwarzania substratów do hodowli komórkowych o fizjologicznie istotnych zakrzywionych geometriach i mikrowzorach białek zewnątrzkomórkowych, co pozwala na systematyczne badania nad komórkowym wykrywaniem tych zewnątrzkomórkowych sygnałów.

Generowanie wielokierunkowych mikrośrodowisk komórkowych za pomocą fotomodelingu UV trójwymiarowych substratów do hodowli komórkowych

Poznaj litografię plazmową do tworzenia mikrośrodowisk komórkowych na powierzchniach wzorcowanych. Ta metoda umożliwia badanie zachowań komórek nerwowych i mięśniowych w kontrolowanych warunkach in vitro.

Wzornictwo powierzchni metodą litografii plazmowej do tworzenia sieci komórkowych

Przeglądaj więcej filmów