Litografia plazmowa Modelowanie powierzchni do tworzenia sieci komórkowych
June 14th, 2011
Wszechstronna technika litografii plazmowej została opracowana do generowania stabilnych wzorów powierzchniowych do kierowania przyczepianiem komórek. Technika ta może być stosowana do tworzenia sieci komórkowych, w tym tych, które naśladują naturalne tkanki i została wykorzystana do badania kilku różnych typów komórek.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest stworzenie mikrośrodowisk komórkowych w celu zbadania kwestii biologicznych związanych z indywidualnymi i grupowymi zachowaniami komórek, które mają miejsce w skali mikro i nano. Osiąga się to poprzez zaprojektowanie najpierw szablonów, które ostatecznie będą kierować rozmieszczeniem komórek. Następnie projekty te są następnie przekształcane w powierzchnie wzorów za pomocą fotolitografii, co pozwala na tworzenie form ekranujących plazmę za pomocą miękkiej litografii.
Wreszcie, te formy ekranujące są ułożone jako statyw na szalce Petriego, aby umożliwić selektywną ekspozycję leżących pod spodem powierzchni na plazmę, która pozostawi wrażliwy na komórkę wzór chemiczny na obszarach pod każdą formą. Można uzyskać wyniki, które pokazują, w jaki sposób zachowanie komórki zależy od jej mikrośrodowiska i interakcji z sąsiednimi komórkami. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące wpływu mikrośrodowisk na zachowanie komórek, takie jak to, w jaki sposób interakcje między grupami komórek wpływają na zjawiska wyższego rzędu?
I w jaki sposób sygnały w nanoskali subkomórkowej wpływają na funkcje, takie jak migracja zdrowia i różnicowanie? Najpierw użyj super kleju, aby przymocować slajd z wzorem do stosu pustych slajdów. Następnie utwórz pojemnik z folii aluminiowej nieco większy niż stos szkiełek i wystarczająco duży, aby pomieścić 30 gramów polidimetylossukanu lub PDMS.
Umieść stos szkiełek w pojemniku, a następnie nawierć PDMS nad stosem szkiełek, aby utworzyć początkową formę. Następnie odgazowuje PDMS, umieszczając pojemnik w komorze próżniowej. Przebij wszelkie pęcherzyki obecne w PDMS, szybko wyjmując i kilkakrotnie umieszczając palec na rurce zaworu dolotowego, aby na krótko umożliwić przepływ powietrza do komory.
Zawór jest zamykany na pięć minut nieprzerwanego odgazowywania. Następnie pozwól PDMS utwardzić się w czystym okapie przepływowym w temperaturze pokojowej przez jeden do dwóch dni. Po utwardzeniu PDMS jest odklejany od wzorca wzorcowego, tworząc formę.
Następnie wlej cienką warstwę sześciu gramów dwuskładnikowej żywicy epoksydowej, która właśnie była mieszana przez minutę, do formy głównej. Natychmiast odgazuj żywicę epoksydową, stosując wiele cykli pękania pęcherzyków, zanim żywica epoksydowa stwardnieje. Po pozostawieniu żywicy epoksydowej Degas w spokoju przez godzinę zostanie ona częściowo utwardzona.
Dodaj więcej żywicy epoksydowej do formy bez odgazowywania, aby uzyskać grubszą strukturę, która będzie łatwiejsza w obsłudze w późniejszych krokach. Następnie pozwól żywicy epoksydowej utwardzić się przez jeden do dwóch dni. Po utwardzeniu formy epoksydowej usuń żywicę epoksydową z formy głównej PDMS, a następnie owiń taśmę wokół formy epoksydowej, aby utworzyć pojemnik.
Działającą formę można następnie utworzyć, wylewając PDMS na formę epoksydową, odgazowując PDMS i utwardzając nową formę przez jeden do dwóch dni. Po utwardzeniu działającej formy zdejmij formę z żywicy epoksydowej i przechowuj obie na szalkach Petriego w szczelnie zamkniętym plastikowym pojemniku wewnątrz okapu przepływowego, aby utrzymać czystość. Aby przygotować formę do wzoru powierzchniowego, wytnij małe odcinki formy roboczej żyletką i umieść sekcje na szalce Petriego.
Lokalizacje tych sekcji formy są oznaczone na odwrocie szalki Petriego trwałym markerem, tworząc kontur wokół miejsca, w którym znajdują się sekcje formy, uformuj statyw z sekcji i poczekaj, aż statyw zapewni konforemny kontakt między formą roboczą a powierzchnią szalki Petriego. Spójrz na spód naczynia, aby potwierdzić dobre umieszczenie, o czym świadczy obecność kanałów, które można zobaczyć gołym okiem lub za pomocą małej soczewki powiększającej. Umieść zespół w komorze plazmowej.
Leczenie osoczem należy rozpocząć po poddaniu go działaniu osocza. Usuń układ formy i ciężaru i umieść szalkę Petriego w komorze bezpieczeństwa biologicznego pod światłem UV na 10 minut w celu sterylizacji. Przechowuj tam naczynie, aż zostanie obsiane komórkami.
Rozcieńczyć wybrane komórki eksperymentalne w ich standardowych pożywkach hodowlanych, aby osiągnąć pożądaną konfluencję. Po umieszczeniu na wzorzystej powierzchni szalki Petriego, wlej trzy mililitry roztworu komórkowego do szalki Petriego. Inkubuj wzorzystą szalkę Petriego w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla, 100% wilgotności przez kilka godzin do kilku dni, aby umożliwić komórkom złożenie się na wzór utworzony przez komórkę plazmatyczną.
Wzór jest sprawdzany za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. Podczas hodowli komórek nerwiaka zarodkowego dodawaj 10 mikromolów kwasu retinowego dziennie, aż zaobserwuje się różnicowanie komórek do stanu podobnego do neuronu. Standardową pożywkę do hodowli komórkowych należy wymieniać co trzy do czterech dni.
Typowym rezultatem zastosowania techniki litografii plazmowej jest powstanie wzoru komórek, który przypomina jakąś arbitralną lub naturalną strukturę. Przykład tego można zobaczyć na tym rysunku z neuronami, które zostały zróżnicowane za pomocą kwasu retinowego na wzór linii. I tutaj, na tym rysunku, gdzie zostały stworzone linie i sieci neuronów, typy komórek inne niż neurony mogą być również użyte, jak widać na tych dwóch następnych rysunkach, ten rysunek pokazuje ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej, a ten rysunek pokazuje C dwie komórki mięśni szkieletowych C 12 tworzące siatki, jak widać. Tu.
Materiały takie jak polilizyna mogą być również wzorowane, aby ułatwić przyczepianie niektórych typów komórek i do innych zastosowań Zgodnie z tą procedurą, można przeprowadzić włączenie dodatkowych danych wejściowych, takich jak mikrofluidyka, sondowanie komórek lub manipulacja genetyczna określonych białek, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, w jaki sposób kombinacje bodźców wpływają na zachowanie wyższego rzędu i indywidualne zachowanie komórki?
Overview
Opracowano wszechstronną technikę litografii plazmowej w celu stworzenia stabilnych wzorców na powierzchni, które kierują przyczepianiem komórek. Ta metoda pozwala na tworzenie sieci komórkowych, które naśladują naturalne tkanki i ułatwiają badanie różnych typów komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Neuronauki
- Biomateriały
Tło
- Rozumienie zachowania komórek w skali mikroskopijnej i nanoskopijnej jest kluczowe dla badań biologicznych.
- Środowiska mikrokomórkowe znacząco wpływają na zachowanie pojedynczych i grupowych komórek.
- Litografia plazmowa zapewnia metodę tworzenia kontrolowanych środowisk do badania tych zachowań.
- Poprzednie techniki nie miały wszechstronności w tworzeniu wzorców dla różnych typów komórek.
Cel badania
- Opracowanie metody tworzenia mikrośrodowisk komórkowych, które kierują rozmieszczeniem komórek.
- Zbadanie, jak mikrośrodowiska wpływają na zachowanie komórek i interakcje między nimi.
- Zbadanie implikacji wskazówek na skalę nanoskopijną na funkcje komórkowe takie jak migracja i różnicowanie.
Zastosowane metody
- Projektowanie szablonów do rozmieszczania komórek.
- Wykorzystanie fotolitografii do stworzenia form osłonowych dla plazmy.
- Zastosowanie obróbki plazmowej do generowania chemicznych wzorców na powierzchniach.
- Wysiew komórek na powierzchniach wzorcowych i obserwacja ich zachowania.
Główne wyniki
- Udana formacja wzorców komórkowych przypominających naturalne struktury.
- Wykazana różnicowanie komórek neuroblastomu w stany przypominające neurony.
- Obserwowane interakcje między różnymi typami komórek na powierzchniach wzorcowych.
- Podkreślenie roli mikrośrodowisk w wpływaniu na zachowanie komórek.
Konkluzje
- Technika litografii plazmowej jest skuteczna w badaniu zachowania komórek w kontrolowanych środowiskach.
- Ta metoda może być dostosowana do różnych typów komórek i pytań badawczych.
- Przyszłe badania mogą uwzględnić dodatkowe techniki w celu dalszego zbadania interakcji komórkowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Plasma lithography surface patterning enables precise engineering of cell microenvironments, supporting high-resolution studies of cell behavior and interaction. This capability is critical for de-risking early discovery hypotheses and advancing predictive models of tissue formation and cellular signaling. The method's stability and compatibility with diverse cell types position it as a reusable platform for translational research and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of cellular responses to defined microenvironmental cues.
- Supports mechanistic de-risking by isolating variables such as migration, adhesion, and differentiation.
- Facilitates functional target validation through controlled cell network formation.
- Improves predictive confidence in pathway and phenotype-based discovery.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible patterned substrates for quantitative cell-based assays.
- Enables scalable preparation of assay-ready surfaces for compound screening.
- Supports robust evaluation of cell behavior under defined spatial constraints.
- Allows for platform reuse across multiple cell types and experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro cell networks with disease-relevant tissue architectures for translational continuity.
- Facilitates long-term studies of differentiation, adaptation, and cell-cell signaling.
- Supports risk-adjusted advancement of preclinical models by enabling discrete manipulation of cellular environments.
- Enhances biomarker discovery through controlled observation of cell interactions.
Pipeline & Workflow Integration
This plasma lithography method integrates from early discovery through assay development and into preclinical research, enabling seamless hypothesis testing and model validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven studies of cell behavior and network formation under defined chemical patterns.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for comparing cellular responses to experimental variables.
- Analytics: Provides high-content readouts for migration, adhesion, and differentiation metrics.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by mimicking native tissue structures.
- Enterprise Reuse: Offers a stable, biocompatible platform adaptable to multiple R&D programs and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-based studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible patterned substrates for diverse workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio progression.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and preclinical assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface chemistry, photolithography, and cell culture techniques.
- Needs access to plasma chambers, clean flow hoods, and microscopy infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducibility across experiments and sites.
- Adaptable to various polymeric substrates and compatible with multiple cell types.
- Pattern stability supports long-term studies but may require optimization for specific applications.
