Izolacja i hodowla pierwotnych embrionalnych neuronów dopaminowych śródmózgowia myszy

Weźmy tkankę dna śródmózgowia wyizolowaną z brzusznego obszaru śródmózgowia zarodków myszy.

Tkanka jest bogata w rozwijające się neurony dopaminowe, które uwalniają neuroprzekaźnik dopaminę.

Dodaj roztwór enzymu, aby rozbić macierz tkankową, rozluźniając w ten sposób komórki.

Dodać roztwór surowicy zawierający DNazę I i mechanicznie zdysocjować strawioną tkankę w celu wytworzenia zawiesiny komórkowej. Białka surowicy hamują enzymy, podczas gdy DNaza I degraduje zewnątrzkomórkowe DNA uwalniane podczas lizy komórek, zapobiegając zlepianiu się komórek.

Pozwól resztkom tkanek osiąść i przenieś zawieszone komórki do świeżej probówki.

Odwirować i usunąć supernatant, a następnie ponownie zawiesić komórki w pożywce neuronów dopaminowych lub DPM.

Weź mikropłytkę pokrytą substratem do hodowli komórkowej w środku studzienek, tworząc mikrowyspy.

Przenieś komórki do środka mikrowysp, aby wyhodować je w dużej gęstości.

Inkubuj, pozwalając komórkom przylegać do mikrowysp.

Napełnij studzienki DPM i inkubuj, ułatwiając wzrost neuronów dopaminowych.

Aby skonfigurować pierwotne embrionalne kultury śródmózgowia z zarodków myszy w 13,5 dniu embrionalnym, zbierz wszystkie zebrane podłogi śródmózgowia w tej samej 1,5-mililitrowej probówce i umyj próbki trzykrotnie, za pomocą 500 mikrolitrów HBSS bez wapnia i magnezu na pranie. Po ostatnim praniu zastąp HBSS 0,5% trypsyną na 30-minutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji dodać 500 mikrolitrów świeżo przygotowanej DNazy I w roztworze FBS do częściowo strawionej tkanki i użyć pipety ze szkła silikonowanego z wypolerowaną ogniowo końcówką do roztarcia tkanki. Gdy można zaobserwować tylko małe, ledwo widoczne cząstki, pozwól tym fragmentom tkanki osiąść na dnie probówki mikrowirówki i przenieś supernatant do pustej stożkowej probówki polipropylenowej o pojemności 15 mililitrów.

Dodać jeden mililitr HBSS do probówki zawierającej DNazę I w FBS i kilkakrotnie wymieszać pipetując. Przenieś jeden mililitr tego roztworu na pozostałe cząstki tkanki i ponownie rozcieraj próbki. Następnie połączyć strawioną zawiesinę komórkową z probówką z supernatantem, nie przenosząc żadnych pozostałych fragmentów tkanki. Po ponownym rozwarstwieniu próbki tkanki pozostałą DNazą I w FBS w HBS, należy osadzać pobrane komórki przez odwirowanie i odessać supernatant bez naruszania osadu.

Umyj komórki dwa razy w dwóch mililitrach podgrzanej pożywki neuronów dopaminowych na płukanie i ponownie zawieś komórki w temperaturze 3 x 10⁴ komórek na sześć mikrolitrów świeżego, ciepłego stężenia pożywki w probówce do mikrowirówki. Następnie usuń pożywkę z każdej wcześniej przygotowanej mikrowyspy i wymieszaj komórki delikatnym pipetowaniem przed użyciem pipety o pojemności 10 mikrolitrów, aby dodać sześć mikrolitrów komórek do każdej mikrowyspy.

Po dodaniu wszystkich komórek należy napełnić puste studzienki na krawędziach płytki 150 mikrolitrami wody lub PBS i umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na jedną godzinę. Pod koniec inkubacji dodać 100 mikrolitrów świeżej pożywki neuronów dopaminowych do każdej studzienki i włożyć płytkę z powrotem do inkubatora.