Różnicowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w neuronalne komórki progenitorowe

Pobrać mikropłytkę zawierającą przylegającą kulturę mysich fibroblastów embrionalnych lub MEF w pożywce.

Przylegające MEF-y działają jako warstwa zasilająca, zapewniając wspierające mikrośrodowisko hodowli komórkowych.

Usuń pożywkę i wprowadź indukowane przez człowieka pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) do pożywki hiPSC uzupełnionej małymi cząsteczkami, które zwiększają przeżywalność komórek.

Inkubuj, aby hiPSC mogły przylegać do warstwy zasilającej, która wydziela czynniki wzrostu ułatwiające proliferację hiPSC.

Usuń pożywkę i dodaj roztwór enzymu, aby odłączyć komórki. Przenieść komórki i odwirować je, a następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić w pożywce hiPSC.

Przenieś komórki na płytkę pokrytą biopolimerem. Inkubuj, aby umożliwić MEF-om przyleganie.

Przenieść zawieszone hiPSC na mikropłytkę z dnem w kształcie litery V. Odwiruj komórki i inkubuj je, indukując tworzenie agregatów komórkowych.

Uzupełnij pożywką różnicującą. Składniki odżywcze pożywki i interakcje komórka-komórka w obrębie agregatu ułatwiają różnicowanie hiPSC w nerwowe komórki progenitorowe.

W przypadku tego protokołu zacznij od ustanowienia komórek zasilających. Aby ustalić tę kulturę, umieść 600 000 komórek zasilających w każdym dołku sześciodołkowej płytki, z 300 mililitrami pożywki na dołek. Po hodowli komórek karmiciela przez 48 godzin wymień pożywkę i inkubuj płytki przez godzinę, przygotowując komórki macierzyste.

Rozmrozić komórki macierzyste w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po rozmrożeniu przenieś komórki do 15-mililitrowej stożkowej probówki i napełnij probówkę do 5 mililitrów pożywką hodowlaną, dodawaną kroplami. Następnie delikatnie odwiruj komórki przez cztery minuty. Odessać supernatant i delikatnie zawiesić osad w 1 mililitrze pożywki z komórkami macierzystymi z inhibitorem ROCK.

Po ilościowym określeniu gęstości komórek, umieść 300 000 komórek macierzystych na komórkach zasilających. Następnie hoduj i rozszerzaj kultury, okresowo selekcjonując zdrowe komórki. Po ekspansji i zamrożeniu komórek w celu uzyskania kopii zapasowej, hoduj kolonie komórek macierzystych na standardowych płytkach, aż osiągną 50% do 70% konfluencji.

Następnie zastosuj łagodną obróbkę enzymatyczną i delikatne miareczkowanie za pomocą 1-mililitrowej końcówki pipety, aby zebrać HIPSC w celu różnicowania neuronalnych komórek prekursorowych. Delikatnie odwirować zawiesinę, odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 mililitrach ludzkiego podłoża iPSC. Następnie przenieś zawiesinę komórkową do 0,1% pokrytego żelatyną 5-centymetrowego naczynia do hodowli komórek i inkubuj płytkę przez godzinę.

Po godzinie przenieś nieprzylegające komórki do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Następnie delikatnie opłucz płytkę 3 mililitrami podłoża i przenieś ją do tej samej probówki. Następnie powtórzyć etap ponownego zawieszania z delikatnym odwirowaniem.

Następnie określ gęstość komórek i umieść je na 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery V o niskiej adhezji przy 9,000 komórek na dołek. Teraz obracaj płytką przez trzy minuty i rozpocznij hodowlę komórek. Przez następne 14 dni, co drugi dzień, wymieniaj połowę pożywki na świeżą, różnicującą pożywkę.