$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Umieść szkiełko podstawowe z utrwaloną próbką tkanki w buforze do pobierania antygenu i podgrzej je.
Podwyższona temperatura i zasadowe pH buforu przerywają wiązania krzyżowe białek wywołane wiązaniem, odsłaniając epitopy antygenów.
Schłodzić szkiełko, aby zapobiec uszkodzeniom tkanek wywołanym wysoką temperaturą, a następnie spłukać, aby usunąć nadmiar buforu.
Zastosuj barierę hydrofobową i umieść szkiełko w komorze wilgotnościowej.
Dodaj bufor blokujący przenikanie. Detergent zawarty w buforze przenika przez błony komórkowe, a białka blokujące maskują niespecyficzne miejsca wiązania, aby zmniejszyć barwienie tła.
Usuń nadmiar buforu, dodaj koktajl przeciwciał sprzężonych z metalem i inkubuj, aby umożliwić wiązanie przeciwciał ze specyficznymi antygenami.
Umyć szkiełko, usuwając niezwiązane przeciwciała.
Dodaj sprzężone z metalem barwienie jądrowe, które dostaje się do komórek i wiąże się z DNA.
Spłucz nadmiar plamy i osusz szkiełko.
Za pomocą skanera optycznego można uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości cech strukturalnych tkanki, co pomaga w interpretacji danych z analizy obrazowej cytometrii masowej barwionej próbki.
Rozpocznij od wstępnie potraktowanego wycinka tkanki o grubości pięciu mikrometrów, zamontowanego na szkiełku zgodnym z barwieniem immunologicznym. Umieść slajdy w koperze do przenoszenia.
W celu pobrania epitopu wywołanego ciepłem lub HIER, dodaj bufor HIER do szkiełka, aż tkanka zostanie całkowicie zanurzona. Umieść kopertę szkiełkową w komorze maskującej i uruchom program ogrzewania.
Po zakończeniu programu umieść kopertę do slajdów na tacy wypełnionej zimną wodą i pozwól jej ostygnąć. Kilkakrotnie przepłukać szkiełka wodą destylowaną, stopniowo zwiększając objętość.
Wyjmij szkiełka z koperty do slajdów i zetrzyj nadmiar bufora. Aby zapobiec utracie buforu blokującego i przeciwciał, należy otoczyć tkankę za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego.
Inkubuj szkiełka w dostosowanej do potrzeb komory wilgotnościowej przez godzinę. W przypadku niespecyficznego blokowania należy dodać bufor blokujący do szkiełek w komorze wilgotnościowej. Po okresie inkubacji usunąć nadmiar buforu blokującego i pozostawić pozostały bufor do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej.
Ostrożnie dodaj roztwór przeciwciała na tkankę i inkubuj przez noc w komorze wilgotnościowej w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Po inkubacji przemywać szkiełko PBS zawierającym tryton przez 5 minut. Na koniec przepłukać szkiełko dwukrotnie PBS przez 5 minut każdy. Teraz potraktuj tkankę barwnikiem interkalatorowym i inkubuj ją w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej przez trzydzieści minut.
Po inkubacji przemyć szkiełko wodą o wysokiej jakości HPLC przez pięć minut i wysuszyć je w eksykatorze przez trzydzieści minut.
Po wyschnięciu szkiełka zeskanuj go za pomocą płaskiego skanera dokumentów z rozdzielczością nie mniejszą niż 1200 punktów na cal.