Nagrania patch-clamp z dendrytu neuronu dopaminergicznego w wycinku mózgu

Rozpocznij od konfiguracji elektrofizjologicznej z unieruchomionym wycinkiem mózgu zanurzonym w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym lub CSF zawierającym różne jony.

Zestaw obejmuje pipetę punktową wypełnioną roztworem bogatym w potas, podłączoną do elektrody rejestrującej i wzmacniacza.

Zastosuj dodatnie ciśnienie powietrza do pipety, aby zapobiec jej zatkaniu. Następnie umieść go w pobliżu dendrytu, przedłużenia neuronu dopaminergicznego odbierającego sygnał.

Powstałe wgłębienia membranowe potwierdzają bliskość dendrytu.

Zwolnij nadciśnienie, aby wytworzyć ssanie, tworząc szczelne uszczelnienie między pipetą a membraną dendrytyczną.

Zapisz początkowy ruch jonów jako prąd działania przy napięciu linii podstawowej.

Przepływowy aCSF z blokerami kanałów sodowych i wapniowych, które blokują odpowiednie kanały, zapobiegając przepływowi jonów przez nie.

Zastosuj ujemne napięcie, aby otworzyć kanał kationowy bramkowany napięciem.

Kanał ten umożliwia jonom potasu przedostanie się do neuronu, zwiększając prąd działania i sugerując stymulację dendrytu w neuronie dopaminergicznym.

W tej procedurze przenieś wycinek mózgu do komory nagrywającej. Zakotwicz plasterek na dnie komory nagraniowej za pomocą platynowego pierścienia i upewnij się, że plasterek jest dobrej jakości i ma gładką, równą powierzchnię. Następnie wybierz neuron z dendrytem rozciągającym się na dużą odległość w tej samej płaszczyźnie i upewnij się, że interesujący go dendryt może być śledzony do dobrze zdefiniowanej somy. Następnie napełnij pipetę z plastrem roztworem elektrody.

Aby załatać dendryt w trybie przyłączonym do komórki, zidentyfikuj i skup się na części dendrytu. Zastosuj nadciśnienie do pipety i obniż ją za pomocą mikromanipulatora. Następnie umieść pipetę blisko membrany i wyreguluj ciśnienie, aby utworzyć małe wgłębienie. Następnie zwolnij nacisk na końcówkę pipety i załataj dendryt, kontrolując opór pipety. Spróbuj uzyskać rezystancję uszczelnienia większą niż 1 giga omów, w najlepszym przypadku od 3 do 10 giga omów w przypadku nagrań podłączonych do komórek.

Następnie odsuń pipetę od membrany o kilka mikrometrów, aby uniknąć deformacji dendrytu. Widoczne tutaj prądy czynnościowe reprezentują spontaniczne potencjały czynnościowe neuronów nikralnych. Aby stłumić prądy działania, zastosuj blokery kanału wapniowego i sodowego do ACSF. Następnie zastosuj krok napięcia ujemny 90 miliwoltów z potencjału podtrzymania 0 miliwoltów, aby wywołać prąd kationowy aktywowany hiperpolaryzacją.