JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:45 min • July 8th, 2025
Weźmy wycinek pnia mózgu myszy zawierający przyśrodkowe jądro przedsionkowe lub MVN.
Zabezpiecz plasterek w komorze rejestracyjnej wypełnionej sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym, aby utrzymać żywotność neuronów.
Wizualizuj wycinek pod mikroskopem, aby zlokalizować neurony MVN.
Zastosuj nadciśnienie, aby przepchnąć mikropipetę wypełnioną wewnątrzkomórkowym roztworem naśladującym środowisko przez tkankę.
Gdy pipeta styka się z neuronem, błona neuronalna ulega wgłębieniu.
Zastosuj podciśnienie, aby zassać niewielką część membrany, tworząc szczelne uszczelnienie.
Następnie zastosuj impulsy podciśnienia, aby rozerwać membranę, tworząc ciągłe połączenie między neuronem a pipetą.
Zastosuj losowe amplitudy szumu do neuronu i zidentyfikuj amplitudę podprogową, powyżej której szum indukuje odpalanie neuronów.
Na koniec zastosuj szereg bodźców elektrycznych do neuronu w połączeniu z podprogową amplitudą losowego szumu.
Zmierz wzmocnienie neuronu — zdolność neuronu do modulowania swojej odpowiedzi na bodźce w obecności hałasu.
W przypadku elektrofizjologii klamer krosowych dla całych komórek, najpierw wyciągnij mikropipety o końcowej rezystancji, która będzie wynosić od 3 do 5 megaomów po napełnieniu wewnętrznym roztworem na bazie potasu, a następnie umieść w kąpieli. Aby uzyskać nagrania klamry krosowej całej komórki z pojedynczych neuronów w MVN, przenieś pojedynczy wycinek tkanki z komory inkubacyjnej do komory rejestracyjnej standardowego układu elektrofizjologicznego i użyj nylonowej nici na ciężarku w kształcie litery U, aby zabezpieczyć plaster
.Stale perfundować komorę rejestracyjną karbogenicznym aCSF w temperaturze 25 stopni Celsjusza przy natężeniu przepływu trzech mililitrów na minutę i napełnić mikropipetę roztworem wewnętrznym. Zastosuj niewielką ilość nadciśnienia za pomocą pipety, aby odepchnąć zanieczyszczenia od końcówki pipety. Korzystając z obiektywu o niższej mocy, zlokalizuj MVN przed przełączeniem na wysoką moc, aby zlokalizować poszczególne neurony w MVN.
Przed naruszeniem tkanki pipetą należy zastosować niewielki nadciśnienie, aby odepchnąć zanieczyszczenia od końcówki pipety, a następnie użyć mikromanipulatora, aby przesunąć pipetę w kierunku wybranego neuronu. Na błonie neuronalnej powinien powstać mały wgłębienie. Zwolnij nadciśnienie i zastosuj niewielką ilość podciśnienia.
Po uzyskaniu uszczelnienia o wartości jednego gigaoma należy zastosować delikatne, krótkie i ostre podciśnienie do uchwytu pipety przez port ssący, aby rozerwać membranę i utworzyć konfigurację całej komórki. Następnie uzyskaj zapisy cęgów prądowych całego ogniwa zgodnie ze standardowymi protokołami.
Aby zastosować szum stochastyczny i sinusoidalny do poszczególnych neuronów przyśrodkowego jądra przedsionkowego, ustaw zakres amplitud od 3 do 24 pikoamperów, aby określić próg neuronalny i szybkość odpalania, a następnie pogrupuj niższe i wyższe intensywności bodźca, aby określić próg czuciowy.
Następnie oblicz średnią szybkość wypalania w ciągu 10-sekundowego okresu, w którym krok prądu depolaryzującego zostanie wstrzyknięty dla każdego indywidualnego poziomu prądu. Użyj średnich wartości szybkości strzelania, aby wygenerować szybkość wypalania w stosunku do bieżącego wykresu. Następnie wykonaj analizę regresji liniowej, aby określić gradient linii najlepszego dopasowania w celu określenia wzmocnienia neuronów.