Zapisy elektrofizjologiczne do oceny regeneracji neuronów w współhodowanych wycinkach rdzenia kręgowego

Weźmy matrycę wieloelektrodową pokrytą polimerem lub MEA, ze współhodowanymi embrionalnymi wycinkami rdzenia kręgowego umieszczonymi w dwóch oddzielnych strefach, co pozwala na jednoczesne nagrywanie z obu warstw.

Wycinek pokazuje zregenerowane połączenia nerwowe w obszarze wcześniej zmienionym chorobowo.

Umieść MEA w komorze rejestracyjnej zawierającej zewnątrzkomórkowy roztwór bogaty w jony i składniki odżywcze, aby utrzymać przeżycie neuronów.

Pozwól systemowi ustabilizować się, ułatwiając adaptację neuronów i komunikację.

Neurony komunikują się za pomocą sygnałów elektrycznych zwanych potencjałami czynnościowymi, które są rejestrowane przez pobliskie elektrody w MEA.

Indywidualne sygnały z każdej elektrody są łączone, wytwarzając sygnał elektryczny z każdej warstwy.

Regularnie wymieniaj roztwór zewnątrzkomórkowy, aby utrzymać stabilność neuronów.

Dodaj roztwór zewnątrzkomórkowy z inhibitorami, które blokują hamujące receptory neuroprzekaźników na błonach neuronalnych, utrzymując aktywność neuronów przez dłuższy czas.

Porównaj aktywność elektryczną z obu wycinków. Zsynchronizowany sygnał elektryczny między dwoma warstwami potwierdza połączenia synaptyczne i udaną regenerację neuronów.

Umieścić szalkę Petriego z pokrytym układem mikroelektrod w środku pod mikroskopem stereoskopowym. Ustaw ostrość matrycy i wyśrodkuj sześciomikrolitrową kroplę osocza kurzego na matrycy elektrod. Za pomocą małej szpatułki ostrożnie wsuń dwa odcinki rdzenia kręgowego tak, aby ich brzuszne strony były skierowane do siebie, do kropli osocza.

Następnie dodaj osiem mikrolitrów trombiny wokół kropelki osocza kurczaka. Następnie za pomocą końcówki pipety ostrożnie wymieszaj i rozprowadź mieszaninę osocza kurczaka i trombiny. Tuż przed tym, jak mieszanina osocza i trombiny kurczaka stanie się zbyt żylasta i zacznie krzepnąć, odessaj nadmiar płynu. Następnie przykryj szalkę Petriego i umieść ją w wilgotnej komorze.

Umieść komorę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na około godzinę. Po inkubacji ostrożnie dodaj do próbki 10 mikrolitrów pożywki. Zakryj szalkę Petriego i umieść ją z powrotem w inkubatorze na dodatkowe 45 minut. Następnie umieść każdy z zestawów kultur wieloelektrodowych w rurze rolkowej i dodaj trzy mililitry pożywki. Zamknij szczelnie pokrywę i umieść rurkę rolkową w bębnie rolkowym. Obróć bęben z prędkością 1 do 2 obr./min w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Za pomocą sterylnych kleszczyków z gumową końcówką wyjmij zestawy hodowli wieloelektrodowych z rurki rolkowej i umieść je na szalce Petriego pod mikroskopem stereoskopowym. Ustaw ostrość tkanki i sprawdź, czy dwie plastry są połączone. Następnie przytrzymaj zespół stabilnie i umieść ostrze skalpela w rowku układu wieloelektrodowego w pobliżu plasterków tkanki. Trzymaj skalpel raczej poziomo, a następnie podnieś rękojeść skalpela do góry, ale pozwól ostrzu skalpela pozostać w rowku układu w taki sposób, aby ostrze toczyło się od podstawy do końca, przecinając tkankę, zakrywając rowek.

W razie potrzeby odciąć wszelkie pozostałe połączenia tkankowe za pomocą końcówki igły o rozmiarze 25. Pracuj tylko w obszarze w rowku i nie dotykaj delikatnych krawędzi. Włóż zestawy hodowli wieloelektrodowych z powrotem do rurki rolkowej i dodaj trzy mililitry świeżej pożywki do kultur. Następnie umieść rurkę rolkową z powrotem na bębnie rolkowym w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Zamontuj zespół kultur z matrycą wieloelektrodową w komorze zapisu i nałóż około 500 mikrolitrów roztworu zewnątrzkomórkowego na matrycę. Następnie zamontuj zespół na mikroskopie. Odczekaj 10 minut, aż system się ustabilizuje, a następnie rejestruj podstawową spontaniczną aktywność z każdej z elektrod wykrywających aktywność przez 10 minut. Powtórz nagrania w sumie dwa razy.

Aby zapewnić stabilne warunki zewnątrzkomórkowe, wymieniaj roztwór zewnątrzkomórkowy po każdej sesji nagraniowej. W razie potrzeby należy odhamować sieć, stosując roztwór zewnątrzkomórkowy zawierający jeden mikromol strychniny i 10 mikromolów gabazyny i odczekać co najmniej dwie minuty przed zarejestrowaniem aktywności elektrycznej.