JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:10 min. • July 8th, 2025
Zacznij od komory rejestrującej zachowanie zawierającej znieczuloną, transgeniczną larwę danio pręgowanego unieruchomioną w niskotopliwej agarozie.
Obszar przedtectum śródmózgowia larwy i dolny płat podwzgórza zawierają zmodyfikowane neurony wyrażające fluorescencyjne wskaźniki wapnia.
Usuń agarozę wokół głowy larwy i umyj wodą, aby usunąć resztki agarozy.
Umieść pantofelek jako zdobycz w pobliżu larwy.
Przenieść komorę zapisu pod mikroskop fluorescencyjny.
Gdy ofiara pływa, oko larwy wykrywa ją i wysyła sygnał do obszarów pretectum i podwzgórza zaangażowanych w wykrywanie zdobyczy.
Otwiera to kanały wapniowe w tych neuronach, umożliwiając jonom wapnia wnikanie i wiązanie się ze wskaźnikami wapnia, co prowadzi do emisji fluorescencji.
Nagraj obrazowanie poklatkowe, aby wykryć intensywność fluorescencji neuronów wzdłuż ścieżki pływania ofiary i wygeneruj kolorową mapę.
Na tej mapie groty strzałek reprezentują trajektorie ofiary: czarne strzałki nie pokazują pobudzenia neuronalnego, podczas gdy kolorowe strzałki wskazują zwiększone pobudzenie neuronów wywołane ruchem ofiary.
Po wyhodowaniu pantofelka i znieczuleniu larwy danio pręgowanego zgodnie z protokołem tekstowym, umieść larwę w 2% agarozie o niskiej temperaturze topnienia i natychmiast usuń nadmiar agarozy, aby powierzchnia agarozy wyglądała na lekko wypukłą. Za pomocą igły preparacyjnej szybko ustaw larwę w pozycji pionowej.
Następnie za pomocą noża chirurgicznego wykonaj kilka małych nacięć w agarozie, aby usunąć agarozę wokół głowy danio pręgowanego, co zapewnia miejsce na pływanie pantofelka. Ostrożnie usuń pozostałą agarozę, delikatnie wlewając wodę systemową do komory. Następnie umieść jeden pantofelek w komorze nagraniowej, aby służył jako bodziec wizualny.
Następnie umieść komorę rejestracyjną pod mikroskopem epifluorescencyjnym wyposażonym w naukową kamerę CMOS i wybierz soczewkę obiektywową 2,5x. Uruchom aplikację do akwizycji obrazu dla wyposażonej kamery. Kliknij przycisk Okienko sekwencji i wybierz opcję Hard Disk Record (Rekord dysku twardego) w okienku. W sekcji Scan Settings (Ustawienia skanowania) ustaw liczbę klatek na 900 lub dowolny inny żądany łączny numer klatki.
W okienku Przechwytywanie ustaw Czas ekspozycji na 30 milisekund i Binning na 2 na 2. Kliknij opcję Live (Na żywo) w okienku przechwytywania, aby zlokalizować larwę w widoku kamery i ustawić ostrość, a następnie kliknij przycisk Stop Live (Zatrzymaj transmisję na żywo) i kliknij przycisk Start (Start). Zapisz film w formacie .cxd i przeanalizuj dane zgodnie z protokołem tekstowym.