JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:01 min. • July 8th, 2025
Weźmy transgeniczne robaki Caenorhabditis elegans rosnące na bloku agaru.
Robaki te wyrażają wskaźnik wapnia, GCaMP5, i niewrażliwe na wapń białko fluorescencyjne, mCherry, w neuronach, które regulują zachowanie związane ze składaniem jaj.
Zamontuj robaki na odwróconym stoliku mikroskopowym.
Wizualizacja fluorescencji GCaMP5 i mCherry.
Przed uwolnieniem komórki jajowej neurony zostają aktywowane, otwierając kanały wapniowe bramkowane napięciem, które umożliwiają napływ wapnia.
Wewnątrzkomórkowy wapń wiąże się z GCaMP5, zmieniając jego konformację i zwiększając fluorescencję.
Tymczasem fluorescencja mCherry pozostaje niezmieniona, co umożliwia śledzenie neuronu.
Aktywowane neurony uwalniają neuroprzekaźniki, które wiążą się z określonymi receptorami mięśniowymi, wywołując uwalnianie komórek jajowych.
Po uwolnieniu kanały wapniowe zamykają się, zmniejszając napływ wapnia i fluorescencję GCaMP5.
Następnie uchwyć obrazy w jasnym polu, aby obserwować ruch robaków.
Zmniejszony ruch występuje z powodu skurczów mięśni przed uwolnieniem jaja.
Po uwolnieniu komórki jajowej mięśnie rozluźniają się, przywracając normalny ruch.
Zmierz współczynnik fluorescencji GCaMP5-mCherry i prędkość robaka, aby wykryć zdarzenia uwalniania jaj.
W przypadku ratiometrycznego obrazowania wapniowego na karcie Sekwencja kliknij przycisk Start, aby rozpocząć nagrywanie, i śledź robaka za pomocą joysticka, utrzymując ostrość na interesujących komórkach i synapsach w środku pola widzenia. W momencie rozpoczęcia zapisu fluorescencyjnego wyzwalacze są wysyłane do oczekującej kamery w jasnym polu i kontrolera sceny, które rozpoczynają zbieranie zsynchronizowanych obrazów i pozycji sceny.
Kliknij przycisk Statystyki w oknie histogramu, aby wyświetlić statystyki pikseli dla każdego kanału. Dostosuj moc diody LED, aby zapewnić maksymalną jednopikselową fluorescencję mCherry na końcu presynaptycznym większą lub równą 8,000 zliczeń w kanale czerwonym, co daje około 12-bitowy zakres dynamiki nad tłem. Sygnały reporterowe wapnia na końcu presynaptycznym podczas spoczynku lub niskiego poziomu wapnia powinny wynosić około 2500 zliczeń w zielonym kanale.
Rejestruj zachowanie, aż do osiągnięcia jednego aktywnego stanu składania jaj. Następnie zapisz 10-minutowy podzbiór zawierający 6 000 klatek przed pierwszym zdarzeniem składania jaj i 6 001 klatek po pierwszym zdarzeniu składania jaj. Należy pamiętać, aby zachować ten sam podzbiór obrazów w jasnym polu zachowania robaka i punktów czasowych pozycji x,y stage lub precyzyjna synchronizacja strumieni danych zostanie utracona.