JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:25 min • July 8th, 2025
Weźmy komorę rejestracyjną zawierającą penetrujący układ mikroelektrod lub PMEA, który rejestruje sygnały elektryczne z tkanki nerwowej.
Podłączyć wlot do butelek zawierających natleniony aCSF i natleniony aCSF z 4-aminopirydyną lub 4-AP za pomocą złącza trójzaworowego.
Podłącz wylot do rury próżniowej.
Podgrzej rurociąg między wlotem a zaworem do temperatury fizjologicznej.
Przy zamkniętym wlocie i wylocie przenieś rozłożony hipokamp do komory.
Pod mikroskopem ustaw hipokamp na PMEA.
Wyjmij roztwór z komory.
Umieść kotwicę tkankową, aby przytrzymać tkankę na elektrodach PMEA.
Otwórz wlot i wylot, aby uruchomić przepływ CSF.
Inkubuj tkankę za pomocą aCSF, aby umożliwić aklimatyzację neuronów.
Następnie przepłyń w CSF z 4-AP. 4-AP blokuje neuronalne kanały potasowe, wydłużając czas trwania potencjału czynnościowego.
PMEA wychwytuje sygnały elektryczne proporcjonalne do wzmocnionego odpalania neuronów z neuronów hipokampa.
W tej procedurze należy napełnić jedną butelkę zwykłym aCSF, a drugą butelką 4-AP aCSF. Bąbelki roztworów z 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla od początku eksperymentów. Użyj łącznika trójzaworowego, aby kontrolować, które rozwiązanie zostanie wybrane podczas eksperymentu.
Następnie podłącz rurkę próżniową do wylotu komory, aby usunąć roztwór do pojemnika na kurz. Podgrzej rurociąg przed dostarczeniem roztworu do komory rejestracyjnej i utrzymuj go w kontrolowanej temperaturze 35 stopni Celsjusza. Po zamknięciu wlotu i wylotu komory nagrywania, za pomocą specjalnie wykonanego szklanego zakraplacza do pipet przenieś rozłożony hipokamp do komory nagrywającej.
Pod mikroskopem umieść rozłożony hipokamp oczywistą stroną skierowaną w dół, obszarem CA3 skierowanym na zewnątrz i polem CA1 skierowanym w stronę badacza. Ostrożnie odessać roztwór z komory za pomocą pipety próżniowej od krawędzi komory rejestrującej, aż komora wyschnie, a tkanka położy się na matrycy.
Następnie ostrożnie umieść wykonaną na zamówienie kotwicę tkankową na wierzchu tkanki, aby utrzymać rozłożony hipokamp na tablicy. Napełnij komorę nagrywania kilkoma kroplami roztworu. Stopniowo otwieraj wlot i wylot, aby dostosować natężenie przepływu do około dwóch kropli na sekundę w komorze kroplowej kroplówki.
Inkubować tkankę w komorze rejestracyjnej z normalnym płynem CSF przez około jedną minutę. Następnie przełącz dopływ roztworu na rozpuszczony 4-AP aCSF i odpowiednio wyreguluj natężenie przepływu. Inkubować tkankę w rozpuszczonym w 4-AP aCSF przez około 5 do 10 minut przed nagraniem.