Name: Badania skurczu i relaksacji tętnicy krezkowej z wykorzystaniem zautomatyzowanej miografii drutowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną miografię drutową do badania skurczu i relaksacji tętnic krezkowych szczurów. Ta metoda umożliwia precyzyjne pomiary siły naczyń w badaniach kardiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Opisany projekt był wspierany przez granty nr R01 HL064761, R25 HL059868, 1SC1 HL099139 oraz P20 MD000175 przyznane przez National Institutes of Health. Treść publikacji jest wyłączną odpowiedzialnością autorów i niekoniecznie odzwierciedla oficjalne stanowisko National Institutes of Health.

1. Izolacja tętnicy krezkowej szczura
<ol>
 <li>Zanurzyć zwierzę w narkozie z użyciem izofluranu w zamkniętej komorze, a następnie przemyć brzuch alkoholem.</li>
 <li>Wykonać laparotomię w linii środkowej, aby odsłonić kłoikę krezkową.</li>
 <li>Za pomocą nożyczek wyciąć około 85 cm jelita wraz z naczyniami doprowadzającymi z tętnicy krezkowej górnej. Odciąć koniec proksymalny odcinka jelita blisko odźwiernika oraz koniec dystalny w pobliżu połączenia kątniczego. Segmenty jelita izoluje się od szczurów pod głęboką narkozą izofluranową, które zostały poddane eutanazji poprzez punkcję serca przy otwartej klatce piersiowej.</li>
 <li>Umieścić wycięty odcinek w powlekonej szalce Petrigo zawierającej PSS i przeprowadzić dyssekcję tętnicy krezkowej w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przymocować koniec proksymalny jelita po prawej stronie, a pozostałą część jelita przypiąć w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara (tj. koniec proksymalny po lewej stronie, naczynia doprowadzające po przeciwnej stronie jelita).</li>
 <li>Wypreparować segmenty gałęzi II i III wraz z fragmentem segmentu proksymalnego.</li>
 <li>Wypreparować żyłę i wyizolować tętnicę (z V-kształtnym punktem rozgałęzienia), a następnie oczyścić ją poprzez usunięcie tkanki tłuszczowej i łącznej. Unikać bezpośredniego kontaktu z tętnicą, delikatnie odciągając ją pęsetą i przecinając błonę tkanki łącznej.</li>
</ol>
2. Montaż naczynia
<ol>
 <li>Odciąć dwa krótkie odcinki (≈ 4 cm) drutu ze stali nierdzewnej bez zawartości wolframu o średnicy 40 μm i za pomocą precyzyjnej pęsety wprowadzić jeden z nich do światła każdej z tętnic, uważając, aby nie uszkodzić śródbłonka. W razie potrzeby użyć końcówki drutu do udrożnienia światła. Wypływająca z naczynia krew jest dobrym sygnałem, że światło zostało otwarte.</li>
 <li>Napełnić komorę miografu fizjologicznym roztworem soli (PSS; mM: 15 NaCl, 4,7 KCl, 1,4 MgSO4.7H2O, 5 NaHCO3, 1,2 K2HPO4, 1,1 Na2HPO4, 1,0 CaCl2, 20 HEPES oraz 5 glukozy, pH 7,4) z dodatkiem kwasu askorbinowego (10 μM) w temperaturze 37 °C; następnie za pomocą pęsety ostrożnie przenieść nawleczony segment naczynia z szalki Petriego do komory w temperaturze pokojowej, przenieść wycięty proksymalny odcinek naczynia do komory miografu i przeciągnąć koniec wzdłuż drutu, aby wprowadzić go do naczynia. Unikać rozciągania naczynia.</li>
 <li>Zabezpieczyć bliski koniec drutu, obracając go przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, pod bliską śrubą mocującą w prawym zacisku połączonym z mikrometrem. Chwycić wolny koniec drutu pęsetą i zabezpieczyć go, obracając zgodnie z ruchem wskazówek zegara, pod daleką śrubą mocującą w prawym zacisku. Upewnić się, że segment naczynia znajdujący się wzdłuż drutu jest umieszczony w szczelinie między zaciskami, nie mając kontaktu z samym zaciskiem.</li>
 <li>Rozsunąć zaciski za pomocą śrub, ustawić drugi drut równolegle do naczynia i wprowadzić go do dalszego końca światła. Delikatnie przesunąć drut przez światło segmentu naczynia jednym ruchem, używając już zamontowanego drutu jako prowadnicy. Trzymać drut około 1 cm od naczynia, aby uniknąć jego rozciągnięcia podczas tego manewru, i unikać dotykania śródbłonka.</li>
 <li>Zsunąć zaciski i upewnić się, że drugi drut montażowy przesuwa się pod pierwszym, zabezpieczonym w prawym zacisku.</li>
 <li>Zabezpieczyć bliski koniec drugiego drutu, obracając go zgodnie z ruchem wskazówek zegara, pod bliską śrubą mocującą w lewym zacisku połączonym z przetwornikiem.</li>
 <li>Zabezpieczyć daleki koniec drutu pod śrubą mocującą w lewym zacisku i dokręcić, aby naciągnąć drut.</li>
 <li>Po zakończeniu montażu zresetować silnik w „Menu Montażu” (Mounting Menu) i rozpocząć normalizację naczynia.</li>
</ol>
3. Normalizacja
System Auto Dual Wire Myograph- 510A posiada zautomatyzowaną funkcję normalizacji, która jest uruchamiana z menu „Normalization” i pozwala na rozciągnięcie naczynia do znormalizowanego obwodu wewnętrznego zgodnie ze standardową procedurą według protokołu producenta po 30 min równoważenia w temperaturze 37 °C. Następnie do danych dotyczących ciśnienia i obwodu wewnętrznego dopasowywana jest krzywa wykładnicza. Procedura ta określa średnicę światła (d10), którą tętnica posiadałaby in vivo w stanie rozluźnienia i pod wpływem ciśnienia transmuralnego wynoszącego 10 mmHg1. Parametry normalizacji dla tętnicy krezkowej szczura są następujące:
<ol>
 <li>Docelowe ciśnienie transmuralne = 13.3 kPa (10 mm Hg).</li>
 <li>Czas = 60 sec; Czas trwania każdego z etapów normalizacji.</li>
 <li>IC1/IC10 = 0.9 (IC1 = znormalizowany obwód wewnętrzny, IC10 = obwód wewnętrzny odpowiadający ciśnieniu docelowemu).</li>
 <li>Kalibracja okularu 2*Δ (mm/podziałka okularowa); 2 delta jest wprowadzone ze względów programistycznych.</li>
</ol>
Zmierz długość zamocowanej tętnicy krezowej, odczytując wartości z okularu mikroskopu w momencie, gdy linie celownicze znajdują się nad dalszym i bliższym końcem zamocowanego segmentu naczynia. W skrócie, długość zamocowanego segmentu naczynia mierzy się przy maksymalnym powiększeniu za pomocą skalowanego okularu w mikroskopie dissectingowym. Odczyty z okularu z linią celowniczą nad dalszym końcem segmentu (a1) oraz nad bliższym końcem segmentu (a2), podane w podziałkach okularych, należy zmierzyć i zapisać. Wartości te, wraz z odczytami z mikrometru przed i po rozciągnięciu naczynia, są zapisywane i wprowadzane do menu programu w celu obliczenia dopasowanej krzywej oraz średnicy wewnętrznej odpowiadającej docelowemu ciśnieniu transmuralnemu 10 mm Hg
W naszych badaniach tętnice ustawiono na średnicę światła d1 = 0,9 x d10, przy której generowanie siły aktywnej jest maksymalne. Uznaje się, że generowanie siły aktywnej na poziomie ≥ 10 mN w tętnicach krezkowych szczura jest optymalne do kontynuowania eksperymentów. Tkanki wykazujące niższą siłę aktywną zostały odrzucone.
4. Pomiar odpowiedzi
Po normalizacji właściwości mechaniczne i funkcjonalne naczyń są ponownie aktywowane poprzez wykonanie „standardowego startu”, który polega na poddaniu naczyń wielokrotnym aplikacjom (zazwyczaj 2 lub 3) 5 μM fenylefryny (PE) w celu uzyskania powtarzalnych skurczów. Typowy „standardowy start” w naszym laboratorium składa się z serii stymulacji i okresów wypłukiwania w następujący sposób:
<ol>
 <li>Założyć pokrywę komory miografu i rozpocząć napowietrzanie mieszanką 95% powietrza i 5% CO2.</li>
 <li>Wypełnić komorę świeżym roztworem PSS (zawierającym 10 μM kwasu askorbinowego).</li>
 <li>Wywołać skurcz naczynia za pomocą 5 μM PE przez 5 min, a następnie przemyć 4 razy buforem PSS.</li>
 <li>Po ostatnim przemyciu ponownie wypełnić komorę roztworem PSS i odczekać 3 min przed powtórzeniem kroków (ii) i (iii).</li>
</ol>
Po standardowej procedurze przygotowania tętnica jest gotowa do eksperymentu. Rozkurcze skurczonych naczyń ocenia się poprzez kumulatywne dodawanie zwiększających się stężeń CaCl2 (0.5 - 4 mM). W przypadku zastosowania inhibitorów naczynia są wstępnie inkubowane z tymi związkami w komorze miografu przez 20 min i pozostają one obecne podczas przeprowadzania testów.
5. Analiza danych
Dane „Normalizacji” dla naczyń oraz zapisy siły, bezpośrednio przekonwertowane na dane tekstowe, zostały przeanalizowane za pomocą programu graficznego SigmaPlot 1.0 (Systat Software, Point Richmond, CA) i przedstawione na wykresach, jak pokazano na Rysunku 1. Dane zależności stężenie-odpowiedź, obliczone na podstawie zapisów, przeanalizowano poprzez wyznaczenie wartości EC50 z danych eksperymentalnych dopasowanych do czteroparametrowej funkcji logistycznej w menu Pharmacology programu. Porównania między grupami oraz wewnątrz grup przeprowadzono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), a różnice przy p &lt; 0,05 uznano za istotne.
6. Reprezentatywne wyniki:
<table border="1">
 <tbody >
 <tr>
 <th>
 Parametry</th>
 <th>
 Wistar</th>
 <th>
 Dahl wrażliwe na sól</th>
 <th>
 Dahl odporne na sól</th>
 </tr>
 <tr>
 <td>L10 (μm)</td>
 <td>83.26 ± 2.3</td>
 <td>91.52 ± 4.67</td>
 <td>17.45 ± 8.43*</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>X1 </td>
 <td>604.21 ± 41.97</td>
 <td>752.24 ± 85.25</td>
 <td>745.84 ± 110.09</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>r2 </td>
 <td>0.9 ± 0.03</td>
 <td>0.97 ± 0.08</td>
 <td>0.97 ± 0.07</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
*Różnica między wartościami L10 dla szczurów rasy Wistar i DR jest istotna statystycznie. Test normalności Shapiro-Wilka przebiegł pomyślnie (p = 0,58); test równości wariancji przebiegł pomyślnie (p = 0,237).
L10 = średnica wewnętrzna zamocowanego segmentu odpowiadająca docelowemu ciśnieniu transmuralnemu.
X1 = Ustawienie mikro-pozycjonera wymagane do rozciągnięcia zamontowanego naczynia do jego znormalizowanego obwodu wewnętrznego (tj. wartość odczytu mikrometru, przy której przeprowadzono eksperymenty).
r2 = współczynnik regresji dla dopasowania (Xi, Yi) do krzywej wykładniczej.
Uwaga: Szczegółowa procedura jest opisana w instrukcji obsługi systemu miografu 510A6.
Tabela 1. Przykładowy odczyt parametrów normalizacji dla odcinków tętnicy krezkowej u szczurów Wistar, DS i DR z programu podstawowego, przedstawiony w „Menu Normalizacji”. Wartości są średnimi (± SEM) z 5 zwierząt. *Różnice między wartościami L10 dla grup Wistar i DS są istotne statystycznie (p &lt; 0,05).
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <th>
 Wistar</th>
 <th>
 DS</th>
 <th>
 DR</th>
 </tr>
 <tr>
 <td>14.2 ± 0.6</td>
 <td>25.8 ± 2.7*</td>
 <td>20.9 ± 1.3*</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 2. Wygenerowane napięcia (mN) w tętnicach krezkowych wyizolowanych od szczurów Wistar, DS i DR po zastosowaniu 5 μM PE do każdego naczynia. Przedstawione wartości są średnimi (± SEM) z 6-8 zwierząt. *Różnica istotna statystycznie w porównaniu z kontrolą Wistar (p &lt; 0.05).
<img alt="Wykres stanu równowagi statycznej przedstawiający napięcie PE w funkcji czasu podczas eksperymentu z koncentracją Ca²⁺." src="/files/ftp_upload/3119/3119fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1. Ca2+eindukowana rozkurcz depresji tętnicy krezkowej szczura Wistar, skurczonej fenylefryną (PE) i zamocowanej w myografu drucianym w fizjologicznym roztworze soli zawierającym 1 mM Ca2+Tętnicę równoważono przez 30 min w 37 °C przy stałym napowietrzaniu i odpowiedziach na Ca2+e wyznaczono. Reprezentatywny przebieg siły po dodaniu 5 μM PE, a następnie kumulatywne dodatki Ca2+ jest przedstawiony.
<img alt="Wykres napięcia PE w czasie z uwzględnieniem zmian stężenia wapnia i etapów płukania." src="/files/ftp_upload/3119/3119fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Ca2+erozluźnienie wywołane przez [substancja] tętnicy krezkowej szczura DS skurczonej PE, zamocowanej w myografie drucianym w fizjologicznym roztworze soli zawierającym 1 mM Ca2+Tętnicę równoważono przez 30 min w 37 °C przy stałym napowietrzaniu i odpowiedziach na Ca2+e wyznaczono. Reprezentatywny zapis siły po dodaniu 5 μM PE, a następnie kumulatywne dodatki Ca2+ jest przedstawiony. Ca2+ zdolność do rozkurczu była w tej tkance znacznie upośledzona w porównaniu z tkankami pobranymi od szczurów linii Wistar i DR.
<img alt="Wykres zależności napięcia PE od czasu, przedstawiający wpływ stężenia Ca²⁺ na skurcz mięśnia, wraz z etapami przemywania." src="/files/ftp_upload/3119/3119fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Ca2+e-wywołany rozkurcz skurczonej PE tętnicy krezkowej szczura DR, zamocowanej w myografie drucianym w fizjologicznym roztworze soli zawierającym 1 mM Ca2+Tętnicę równoważono przez 30 min w 37 °C przy stałym napowietrzaniu i odpowiedziach na Ca2+e wyznaczono. Reprezentatywny zapis siły po dodaniu 5 μM PE, a następnie kumulatywne dodatki Ca2+ zostało przedstawione.
<img alt="Krzywe odpowiedzi wapniowej, wykres słupkowy wartości EC50, analiza blotu ekspresji CaR w badaniu na szczurach." src="/files/ftp_upload/3119/3119fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. A. [Ca2+]e-krzywe odpowiedzi. B. Wykres słupkowy przedstawiający EC50 wartości relaksacji wyznaczone poprzez dopasowanie danych do czteroparametrycznej krzywej logistycznej. C. Ekspresja CaR w splotach krezkowych wyizolowanych od szczurów DR i DS.

<ol><li>Mulvany, M. J., Halpern, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ.</a> Nature. 260, 617-619 (1976).</li>
<li>Bevan, J. A., Osher, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+method+for+recording+tension+changes+in+the+wall+of+small+blood+vessels+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Agents+Actions%22%5BJournal%5D)">A direct method for recording tension changes in the wall of small blood vessels in vitro.</a> Agents Actions. 2, 257-260 (1972).</li>
<li>Mulvany, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedures+for+investigating+of+small+vessels+using+small+vessel+myograph%5BTitle%5D)+AND+%22DMT+Danish+Myo+Technology%22%5BJournal%5D)">Procedures for investigating of small vessels using small vessel myograph.</a> DMT Danish Myo Technology. , (2004).</li>
<li>Angus, J. A., Wright, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+to+study+the+pharmacodynamics+of+isolated+large+and+small+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Techniques to study the pharmacodynamics of isolated large and small blood vessels.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 44, 395-407 (2000).</li>
<li>Halpern, W., Mulvany, M. J., Warshaw, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+smooth+muscle+cells+in+the+walls+of+arterial+resistance+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of smooth muscle cells in the walls of arterial resistance vessels.</a> J. Physiol. 275, 85-101 (1978).</li>
<li>Lindhorst, J., Alexander, N., Blignaut, J., Rayner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+hypertension+between+blacks+and+whites%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+J.+Afr%22%5BJournal%5D)">Differences in hypertension between blacks and whites: an overview.</a> Cardiovasc. J. Afr. 18, 241-247 (2007).</li>
<li>Eley, S. L., Allen, C. M., Williams, C. L., Bukosi, R. D., Pointer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+thiazide+on+renal+interstitial+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Action of thiazide on renal interstitial calcium.</a> Am. J. Hypertens. 21, 814-819 (2008).</li>
<li>Palmer, C. E., Rudd, M. A., Bujoski, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+interstitial+Ca2%2B+during+sodium+loading+of+normotensive+and+Dal-salt+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Renal interstitial Ca2+ during sodium loading of normotensive and Dal-salt hypertensive rats.</a> Am. J. Hypertens. 16, 771-776 (2003).</li>
<li>Hurwitz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+control+of+plasma+calcium+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Homeostatic control of plasma calcium concentration.</a> Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 31, 41-100 (1996).</li>
<li>Brown, E. M., MacLeod, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+sensing+and+extracellular+calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Extracellular sensing and extracellular calcium signaling.</a> Physiol. Rev. 81, 239-297 (2001).</li>
<li>Breitwieser, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+calcium+as+an+integrator+of+tissue+function%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular calcium as an integrator of tissue function.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 40, 1467-1480 (2008).</li>
<li>Mupanomunda, M. M., Wang, Y., Bukoski, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+chronic+sensory+denervation+on+Ca2%2B-induced+relaxation+of+isolated+mesenteric+resistance+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of chronic sensory denervation on Ca2+-induced relaxation of isolated mesenteric resistance arteries.</a> Am. J. Physiol. 274, 1655-1661 (1998).</li>
<li>Mupanomunda, M. M., Ishioka, N., Bukoski, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+Ca2%2B+undergoes+dynamic+changes+sufficient+to+stimulate+nerve-dependent+Ca2%2B-induced+relaxation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Interstitial Ca2+ undergoes dynamic changes sufficient to stimulate nerve-dependent Ca2+-induced relaxation.</a> Am. J. Physiol. 276, 1035-1042 (1999).</li>
<li>Mupanomunda, M. M., Tian, B., Ishioka, N., Bukoski, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+interstitial+Ca2%2B%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Renal interstitial Ca2+.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 278, F644-F649 (2000).</li>
<li>Awumey, E. M., Hill, S. K., Diz, D. I., Bukoski, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P-450+metabolites+of+2-arachidonoylglycerol+play+a+role+in+Ca2%2B-induced+relaxation+of+rat+mesenteric+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P-450 metabolites of 2-arachidonoylglycerol play a role in Ca2+-induced relaxation of rat mesenteric arteries.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 2363-2370 (2008).</li>
<li>Chen, W., Bergsman, J. B., Wang, X., Gilkey, G., Pierpoint, C. R., Daniel, E. A., Awumey, E. M., Dauban, P., Dodd, R. H., Ruat, M., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+external+calcium+signaling+involves+the+calcium-sensing+receptor+in+neocortical+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Presynaptic external calcium signaling involves the calcium-sensing receptor in neocortical nerve terminals.</a> PloS One. 5, e8563-e8563 (2010).</li>
<li>Bukoski, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+perivascular+sensory+nerve+Ca2%2B+receptor+and+blood+pressure+regulation%3A+a+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hypertens%22%5BJournal%5D)">The perivascular sensory nerve Ca2+ receptor and blood pressure regulation: a hypothesis.</a> Am. J. Hypertens. 11, 1117-1123 (1998).</li>
<li>Bukoski, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+Ca2%2B+and+blood+pressure%3A+evidence+that+Ca2%2B-sensing+receptor+activated+sensory+nerve+dilator+activity+couples+changes+in+interstitial+Ca2%2B+with+vascular%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Dietary Ca2+ and blood pressure: evidence that Ca2+-sensing receptor activated sensory nerve dilator activity couples changes in interstitial Ca2+ with vascular.</a> 16, 218-221 (2001).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Nadciśnienie tętnicze jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności z powodu schorzeń sercowo-naczyniowych, mózgowych oraz nerek. Częstość występowania nadciśnienia w populacji jest wysoka, a nadciśnienie soloodporne występuje szczególnie często u osób starszych oraz częściej u osób rasy czarnej niż białej. Uważa się, że wynika to z tendencji osób rasy czarnej do zatrzymywania sodu w nerkach9. Nadwrażliwość solna jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do chorób nerek i wiąże się z dysfunkcją śródb...

<table><tbody><tr><td>Auto Dual Wire Myograph System-510ADMT-USA, Inc.</td><td>Atlanta, GA.</td><td>10151</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML86/" target="_blank"&gt;System akwizycji danych PowerLab/4SP&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML86/" target="_blank"&gt;ML750&lt;/a&gt;</td><td>Dostępne są nowe modele z 4-16 kanałami wejściowymi.</td></tr><tr><td>Komputer Dell Dimension XPS Gen 4</td><td>Dell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop do sekcji Stemi SV II (Apo) z okularem</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szczury Wistar, Dahl wrażliwe na sól, Dahl odporne na sól</td><td>Harlan Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Karma dla gryzoni</td><td>Harlan Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fenylefryna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inne odczynniki chemiczne</td><td></td><td></td><td>Wszystkie użyte odczynniki chemiczne były o najwyższej dostępnej czystości komercyjnej.</td></tr></tbody></table>

badania skurczu i rozkurczu tętnicy krezkowej z wykorzystaniem zautomatyzowanej miografii drucianej

Mesenteric Artery Contraction and Relaxation Studies Using Automated Wire Myography

Proksymalne naczynia oporowe, takie jak tętnice krezkowe, w znacznym stopniu przyczyniają się do oporu obwodowego. Te małe naczynia o średnicy od 100-400 μm pełnią przede wszystkim funkcję kierowania przepływu krwi do poszczególnych narządów, zgodnie z ogólnymi zapotrzebowaniami organizmu. Tętnica krezkowa szczura ma średnicę większą niż 100 μm. Technika miografii, po raz pierwszy opisana przez Mulvaya i Halperna1, opierała się na metodzie zaproponowanej przez Bevana i Oshera2. Technika ta dostarcza informacji o małych naczyniach w warunkach izometrycznych, w których zapobiega się znacznemu skróceniu preparatu mięśniowego. Ponieważ generowanie siły oraz wrażliwość naczyń na różne agoniści zależą od stopnia rozciągnięcia, zgodnie z zależnością między aktywnym napięciem a długością, kluczowe jest przeprowadzanie badań skurczu w warunkach izometrycznych, aby zapobiec podatności drutów mocujących. Drutom ze stali nierdzewnej preferuje się nad drutami wolframowymi ze względu na utlenianie się tych drugich, co wpływa na rejestrowane odpowiedzi3. Technika ta pozwala na porównanie skurczów naczyń wywołanych agonistami w celu uzyskania dowodów na prawidłowe funkcjonowanie receptorów komórek mięśni gładkich naczyń.
W kilku badaniach wykazaliśmy, że izolowane tętnice krezkowe skurczone fenylefryną rozkurczają się po dodaniu kumulatywnych stężeń pozakomórkowego wapnia (Ca2+e). Wyniki te doprowadziły nas do wniosku, że reakcję wazorelaksacji tę tę pośredniczą okołonaczyniowe nerwy sensoryczne, które wykazują ekspresję sprzężonego z białkiem G receptora wyczuwającego Ca2+ (CaR). Wykorzystując zautomatyzowaną metodę miografii drucianej, wykazujemy tutaj, że tętnice krezkowe szczurów Wistar, Dahl wrażliwych na sól (DS) oraz Dahl odpornych na sól (DR) reagują odmiennie na Ca2+e. Tkanki szczurów Wistar wykazały wyższą wrażliwość na Ca2+ w porównaniu do tkanek szczurów DR i DS. Obniżona ekspresja CaR w tętnicach krezkowych szczurów DS koreluje ze zredukowanym rozkurczaniem izolowanych, uprzednio skurczonych tętnic indukowanym przez Ca2+e. Dane sugerują, że CaR jest niezbędny do rozkurczania tętnic krezkowych przy zwiększonym napięciu adrenergicznym, jak ma to miejsce w nadciśnieniu, oraz wskazują na wrodzony defekt w ścieżce sygnalizacyjnej CaR u zwierząt linii Dahl, który jest znacznie silniejszy u szczurów DS.
Metoda ta jest użyteczna w określaniu reaktywności naczyniowej ex vivo w oporowych tętnicach krezkowych i podobnych małych naczyniach krwionośnych, a porównania między różnymi agonistami i/lub antagonistami mogą być łatwo i spójnie oceniane obok siebie6,7,8.

Opisano zautomatyzowaną metodę miografii do pomiarów siły w izolowanych tętnicach krezkowych. Wykorzystuje ona urządzenie Mulvany-Halpern Auto Dual Wire Myograph 510A do określania reakcji na fenylefrynę oraz wapń zewnątrzkomórkowy. Metoda ta pozwala na spójne określanie odpowiedzi izometrycznych na agonistów w małych naczyniach o średnicach od 60 do 300 μm, niezależnie od siebie.

Badania skurczu i rozkurczu tętnicy krezkowej z wykorzystaniem zautomatyzowanej miografii drucianej

Proksymalne naczynia oporowe, takie jak tętnice krezkowe, w znacznym stopniu przyczyniają się do oporu obwodowego. Te małe naczynia o średnicy od ...

W niniejszej procedurze wykorzystuje się szczury linii doll wrażliwe na sól oraz odporne na sól w celu porównania reaktywności tętnic oporowych krezkowych na wapń zewnątrzkomórkowy pod napięciem wywołanym fenylefryną. W tym celu najpierw izoluje się łuk krezkowy od zwierząt, a następnie preparuje gałęzie tętnic oporowych. Następnie pierwszy z dwóch drutów ze stali nierdzewnej przewleka się przez krótki odcinek wypreparowanej tętnicy, a naczynie montuje się w komorze graficznej.Następnie drugi drut ze stali nierdzewnej jest przewleczony przez światło naczynia równolegle do pierwszego drutu. W kolejnym kroku zamocowane naczynie zostaje rozciągnięte do znormalizowanego obwodu wewnętrznego. Ostatnim etapem procedury jest reaktywacja naczynia poprzez poddawanie go działaniu powtarzających się aplikacji fenylefryny oraz rozluźnianie za pomocą kumulacyjnych aplikacji wapnia.Ostatecznie wyniki wykazują zmiany napięcia w naczyniu, które można przekształcić w krzywą odpowiedzi wapniowej i wykorzystać do wyznaczenia wartości EC 50. Dla porównania: po raz pierwszy pomyśleliśmy o zastosowaniu tej metody, gdy odkryliśmy, że sieć nerwowa w ciałach jamistych szczura wykazuje ekspresję sprzężonego z białkiem G receptora wrażliwego na wapń.Można to badać w ten sam sposób, co w przypadku receptorów goryczy AIC, które są aktywowane przez agonistę. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotykać trudności, ponieważ warstwy śródbłonka i mięśni gładkich są cienkie. Naczynia są łatwo uszkadzane.Jeśli tak się stanie, właściwości mechaniczne tych naczyń mogą zostać upośledzone. Na początek należy przygotować obszar roboczy oraz instrumenty chirurgiczne. Zznieczone zwierzę ułożyć na plecach i przetrzeć brzuch alkoholem.Po wykonaniu laparotomii w linii pośrodkowej, za pomocą nożyczek usunąć około 85 centymetrów jelita, w tym tętnicę krezkową górną. Odciąć koniec proksymalny blisko odźwiernika oraz koniec dystalny w pobliżu złącza kątniczo-krętniczego. Wycięty odcinek umieścić w powlekonej płytce Petriego zawierającej sól fizjologiczną lub PSS w temperaturze pokojowej.Przytwierdź proksymalny koniec jelita po prawej stronie, a następnie przytwierdź pozostałą część jelita, poruszając się w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Następnie wypreparuj odcinek tętnicy krezkowej zawierający odgałęzienia drugie i trzecie oraz fragment jelita od strony proksymalnej. Zidentyfikuj V-kształtny punkt rozgałęzienia tętnicy krezkowej i oddziel go od żyły.Za pomocą pęsety delikatnie odsunąć tkankę tłuszczową i łączną, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu z tętnicą. W celu rozpoczęcia montażu naczynia, należy wyciąć dwa segmenty tętnicy o długości około two millimeters. Do otwarcia światła tętnicy można użyć końcówki czterocentymetrowego drutu ze stali nierdzewnej bez zawartości wolframu o średnicy 40 micrometer.Następnie za pomocą precyzyjnej pęsety wprowadź drut do światła każdej tętnicy. Uważając, aby nie uszkodzić śródbłonka, napełnij komorę z graftem mięśniowym PSS w temperaturze 37°C. Używając pęsety, przenieś segment naczynia z prowadzonym drutem do komory.Następnie przenieś wycięty proksymalny odcinek naczynia do komory mojografu i pociągnij za jego koniec wzdłuż drutu, aby wprowadzić go do naczynia. Unikaj rozciągania naczynia. Zabezpiecz bliski koniec drutu, obracając go przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, pod bliską śrubą mocującą w prawym zacisku połączonym z mikrometrem.Chwyć wolny koniec drutu pęsetą i przymocuj go, obracając zgodnie z ruchem wskazówek zegara, pod dalszą śrubą mocującą w prawym ramieniu zacisku, upewniając się, że odcinek naczynia wzdłuż drutu znajduje się w szczelinie między ramionami, nie dotykając samego zacisku. Rozsuń ramiona zacisku za pomocą śrub. Ustaw drugi drut równolegle do naczynia i wprowadź go do przeciwległego końca światła naczynia.Ostrożnie wprowadź drut przez światło segmentu naczynia jednym ruchem, używając już zamocowanego drutu jako prowadnicy. Trzymaj drut w odległości około jednego centymetra od naczynia, aby uniknąć jego rozciągnięcia podczas manewru oraz aby nie dotykać śródbłonka. Skręć szczęki i upewnij się, że drugi drut montażowy przesuwa się pod pierwszym, który został zabezpieczony po prawej stronie.Przymocuj bliższy koniec drugiego drutu w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara pod bliższą śrubą mocującą lewego szczęki połączonej z przetwornikiem. Przymocuj dalszy koniec drutu pod śrubą mocującą na lewej szczęce i dokręć ją, aby naciągnąć drut. Po zakończeniu montażu odczekaj 30 minut w celu wyrównania temperatury do 37 °C.Po osiągnięciu stanu równowagi silnik zostaje zresetowany z menu montażu i rozpoczynana jest procedura normalizacji, która rozciąga naczynie do znormalizowanego obwodu wewnętrznego. Aby rozpocząć, należy otworzyć menu normalizacji i ustawić docelowe ciśnienie transmuralne na 13.3 kilopascals. Następnie należy ustawić czas trwania każdego z etapów normalizacji na 60 seconds.Stosunek IC 1 do IC 100 powinien wynosić 0,9, a kalibracja IP powinna być ustawiona na tryb „two star delta”. Należy zmierzyć długość zamontowanej tętnicy krezkowej, odczytując wartości z okularu mikroskopu, gdy linie celownicze pokrywają się z przeciwległymi końcami odcinka naczynia. Po normalizacji naczynia są reaktywowane poprzez wykonanie standardowego startu, składającego się z serii stymulacji i okresów wypłukiwania.Najpierw należy założyć pokrywę komory miograficznej i rozpocząć napowietrzanie mieszaniną 95% powietrza i 5% dwutlenku węgla. Napełnij komorę świeżym roztworem PSS zawierającym 100 µM kwasu askorbinowego. Wywołaj skurcz naczynia za pomocą 5 µM fenylefryny (PE) przez pięć minut, a następnie przemyj naczynie czterokrotnie buforem PSS. Po ostatnim płukaniu ponownie napełnij komorę roztworem PSS i odczekaj trzy minuty przed ponownym napełnieniem komory PSS i wywołaniem skurczu za pomocą PE. Jak wykazano wcześniej, tętnica jest teraz gotowa do eksperymentu.Zmierz rozkurcz skurczonych naczyń poprzez kumulatywne dodawanie rosnących stężeń chlorku wapnia. Niniejsza tabela pokazuje, że napięcia podstawowe po zastosowaniu fenylefryny różniły się u szczurów Wistar DS (wrażliwych na sól) oraz DR (opornych na sól). Ten zapis ze szczura Wistar przedstawia rozkurcz tętnic skurczonych PE przy kumulatywnym dodawaniu wapnia; rozkurcz ten był znacznie upośledzony w tkankach szczurów DS w porównaniu ze szczurami Wistar oraz w porównaniu ze szczurami DR. Jak widać tutaj, różnice w wrażliwości na wapń są widoczne na krzywych odpowiedzi na wapń, a także przy obliczaniu wartości EC 50.W końcu szczury DS wykazują obniżenie ekspresji receptora wyczuwającego wapń w tętnicach w porównaniu do szczurów Dr. Po opanowaniu tej techniki można ją przeprowadzić w ciągu dwóch godzin, jeśli jest wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak porównywać reaktywność naczyniową małych tętnic jelitowych na związki egzogenne w warunkach izometrycznych.

mesenteric-artery-contraction-relaxation-studies-using-automated-wire

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Badanie skurczu i rozkurczu tętnic krezkowych za pomocą zautomatyzowanej miografii naciągowej

Pomiary aktywności kanałów potasowych Kv7 (KCNQ) w izolowanych miocytach tętniczych (przy użyciu technik elektrofizjologicznych patch clamp) równolegle z pomiarami odpowiedzi skurczowych/rozkurczowych (przy użyciu myografii ciśnieniowej) mogą dostarczyć istotnych informacji na temat roli kanałów Kv7 w fizjologii i farmakologii mięśni gładkich naczyń krwionośnych.

Badanie funkcji kanałów potasowych Kv7 w mięśniach gładkich tętnic z wykorzystaniem elektrofizjologii patch-clamp i myografii ciśnieniowej

W miografii ciśnieniowej, nienaruszony mały fragment naczynia jest montowany na dwóch małych kaniulach i podbudowywany do odpowiedniego ciśnienia świetlnego. Tutaj opisujemy metodę pomiaru odpowiedzi wazorelaksacyjnej myszy tętnic krezkowych 3. rzędu u myszy c57 i sGCα1-/- myszy za pomocą miografii ciśnieniowej.

Ocena funkcji tętnicy oporowej myszy za pomocą miografii ciśnieniowej

Miografia ciśnieniowa służy do oceny wazoaktywności małych tętnic, które rozwijają trwałe zwężenie pod wpływem ciśnienia. Manuskrypt ten zawiera szczegółowy protokół oceny w izolowanych odcinkach małych tętnic krezkowych u szczurów, wazoaktywności i wpływu ciśnienia śródświetlnego na średnicę naczyń krwionośnych.

Ocena odpowiedzi miogennej i wazoaktywności w opornych tętnicach krezkowych za pomocą miografii ciśnieniowej

Ten manuskrypt opisuje protokoły mikroskopii wideo in vitro do oceny funkcji naczyniowej w tętnicach oporowych mózgu szczurów. W manuskrypcie opisano również techniki oceny gęstości mikronaczyń za pomocą znakowanej fluorescencyjnie lektyny i perfuzji tkanek za pomocą laserowej przepływometrii dopplerowskiej.

Ocena mechanizmów kontroli naczyniowej z wykorzystaniem wideomikroskopii izolowanych tętnic opornych szczurów

Technika wirekowego miografu jest używana do badania funkcji mięśni gładkich naczyń krwionośnych i badania przesiewowego nowych leków. Przedstawiamy szczegółowy protokół pomiaru izometrycznej kurczliwości tętnicy krezkowej myszy oraz badań przesiewowych nowych środków zwiotczających mięśnie gładkie naczyń krwionośnych.

Izometryczny pomiar kurczliwości tętnicy krezkowej myszy za pomocą miografii drutowej

Protokół opisuje użycie miografii drucianej do oceny przezściennego napięcia izometrycznego tętnic krezkowych wyizolowanych od myszy, ze szczególnym uwzględnieniem modulacji przez czynniki uwalniane z komórek śródbłonka i okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej.

Ocena reakcji na napięcie naczyniowe przy użyciu izolowanych tętnic krezkowych z naciskiem na modulację przez okołonaczyniowe tkanki tłuszczowe

Niniejszy protokół opisuje koncepcje i techniczne zastosowanie techniki miografu tensometrycznego z wykorzystaniem wielokomorowego systemu miograficznego w eksperymentalnej ocenie ex vivo funkcji śródbłonka aorty myszy.

Pomiar zależnej od śródbłonka wazorelaksacji w aorcie piersiowej myszy za pomocą tensometrycznej miografii komory o małej objętości

Jelito cienkie jest często narażone na działanie toksyn, które mogą wpływać na przepływ krwi i negatywnie wpływać na wchłanianie składników odżywczych. Za pomocą multimiografu i izolatów tętnic i żył krezkowych można badać pod kątem wazoaktywności związki lub toksyny.

Izolowanie i wykorzystanie odcinków tętnicy i żyły krezkowej bydła jako testu biologicznego do badania wazoaktywności w jelicie cienkim

Opisujemy technikę chirurgiczną, która powoduje uszkodzenie drutu w tętnicy udowej u myszy, aby wywołać przerost neointimalny, który służy jako modelowy system testowania dla okołonaczyniowego dostarczania związków terapeutycznych do hamowania restenozy.

Mysi model uszkodzenia drutu tętnicy udowej z implantacją okołonaczyniowego plastra do dostarczania leków

Model uszkodzenia przewodu tętnicy udowej myszy w restenozie jest technicznie wymagający. W tym protokole pokazujemy kluczowe szczegóły techniczne niezbędne do skutecznego wykonania urazu drutu w celu wywołania spójnej neointimy do badań restenozy.

Mysi model restenozy tętniczej: techniczne aspekty uszkodzenia drutu udowego

Poznaj zautomatyzowaną miografię drutową do badania skurczu i relaksacji tętnic krezkowych szczurów. Ta metoda umożliwia precyzyjne pomiary siły naczyń w badaniach kardiologicznych.

Badania skurczu i rozkurczu tętnicy krezkowej z wykorzystaniem zautomatyzowanej miografii drucianej

Przeglądaj więcej filmów