Wywoływanie żylaków aksonalnych za pomocą bodźca mikromechanicznego na neuronach

Zacznij od przymocowania mikropipety z dołączoną rurką do mikromanipulatora.

Podłącz drugi koniec rurki do strzykawki wypełnionej buforem soli za pomocą złącza z obracanym zaworem.

Ustawić strzykawkę na wysokości zapewniającej wystarczający nacisk do wywołania żylaków w aksonach.

Żylaki aksonów to obrzęki przypominające koraliki, które występują na całej długości aksonu.

Ustawić mikropipetę pod żądanym kątem w stosunku do naczynia hodowlanego.

Użyj światła fluorescencyjnego z mikroskopu, aby wyrównać końcówkę mikropipety i opuścić ją w pobliżu powierzchni naczynia do hodowli komórkowej zawierającego bufor soli.

Teraz włącz przechodzące światło i wyłącz filtr fluorescencyjny.

Umieść szkiełko nakrywkowe z neuronami na szalce.

Najpierw skup się na mikropipecie i dostosuj jej położenie.

Następnie skup się na regionie zawierającym neurony docelowe.

Otwórz zawór, aby zastosować ciśnienie płynu. Ten bodziec mikromechaniczny wywołuje żylaki w tych neuronach.

W tej procedurze włóż pipetę do górnej części mikromanipulatora, aby utrzymać ją na miejscu. Ustawić pipetę pod kątem 45 stopni powierzchnią do naczynia do hodowli komórkowej. Włącz filtr fluorescencyjny. Otwórz przysłonę i upewnij się, że widać fluorescencyjną plamkę przechodzącą przez obiektyw.

Za pomocą mikromanipulatora przesuń pipetę do pozycji, która zrównuje końcówkę z plamką fluorescencyjną, a następnie opuść pipetę do pozycji tuż nad wysokością naczynia do hodowli komórkowej. Gdy znajdzie się na swoim miejscu, włącz przechodzące światło i wyłącz fluorescencję. Za pomocą pęsety przenieś jedno szkiełko nakrywkowe z komórkami skierowanymi w stronę pipety z płytki do hodowli komórkowej na naczynie do hodowli komórkowej zawierające 2 mililitry buforu Hanka w temperaturze pokojowej.

Używając precyzyjnego pokrętła ostrości i 20-krotnego obiektywu, ustaw ostrość na płaszczyźnie około czterech pełnych obrotów nad komórkami. Następnie za pomocą mikromanipulatora ustaw końcówkę pipety tak, aby była skupiona i znajdowała się pośrodku lewej strony płaszczyzny, tak jak widać przez okulary. Gdy pipeta znajdzie się na swoim miejscu, ustaw ostrość mikroskopu na płaszczyźnie, która zawiera obszar zainteresowania.

W obrazowaniu 7DIV, transfekowane GFP mysie neurony hipokampa wykazywały akson przed i po zaciągnięciu.