JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 5:10 min. • July 8th, 2025
Umieść genetycznie zmodyfikowane zarodki danio pręgowanego pod mikroskopem stereoskopowym i obserwuj spontaniczne zwijanie ogona wywoływane przez neurony ruchowe rdzenia kręgowego.
Wewnętrzne właściwości tych neuronów powodują napływ jonów przez kanały sodowe, co prowadzi do spontanicznej depolaryzacji błony i generowania potencjałów czynnościowych, które rozchodzą się do mięśni, wywołując zwijanie ogona. Zmierz częstotliwość zwijania.
Przenieś niektóre zarodki do blokera kanału sodowego, aby zahamować napływ sodu i ocenić zmniejszoną częstotliwość zwijania.
Zamontuj nieleczone zarodki w stopionej agarozie; pozwól agarozie zestalić się, aby ograniczyć ruch, i obserwuj pod mikroskopem fluorescencyjnym.
Neurony ruchowe wyrażają bioczujnik z domeną wykrywającą napięcie związaną z błoną lub VSD, połączoną z fluoroforami donorowymi i akceptorowymi.
Depolaryzacja zmienia konformację VSD, zbliżając fluorofory.
Po wzbudzeniu donor przekazuje energię do akceptora, powodując emisję fluorescencji akceptora.
Dodaj bloker, aby zahamować depolaryzację, co zmniejsza emisję akceptora, potwierdzając hamowanie spontanicznej depolaryzacji w neuronach za pośrednictwem blokera.
W celu spontanicznej analizy zwijania ogona przenieś zarodki na 90-milimetrową okrągłą szalkę Petriego wypełnioną wodą rybią zawierającą 0,2% DMSO i ręcznie odwadniaj je za pomocą dwóch kleszczy jubilerskich z ostrymi końcówkami lub igłami. Następnie inkubuj zarodki przez 5 minut w temperaturze 28 stopni Celsjusza. Za pomocą kamery cyfrowej zamontowanej na mikroskopie stereoskopowym wykryj zwijanie się ogona w temperaturze pokojowej podczas jednominutowego nagrania wideo.
Następnie uzyskaj szereg czasowy w rozdzielczości czasowej 30 klatek na sekundę. Następnie oblicz częstotliwość spontanicznego zwijania ogona, licząc liczbę zagięć na jednostkę czasu. Aby ocenić działanie leku riluzol, przenieś zarodki na nową, 90-milimetrową szalkę Petriego wypełnioną wodą rybną zawierającą 5 mikromolowych riluzolu. Następnie inkubuj zarodki przez 5 minut w temperaturze 28 stopni Celsjusza, a następnie nagraj jednominutowy film i przeprowadź analizę behawioralną.
Teraz zamontuj zarodki od 20 do 24 hpf w agarozie o niskiej temperaturze topnienia 1% w wodzie dla ryb w 35-milimetrowej naczyniu do obrazowania ze szklanym dnem w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Ustaw zarodki na boku i poczekaj, aż agaroza zestali się w temperaturze pokojowej.
Następnie przenieś czaszę obrazowania na etap mikroskopu konfokalnego. Zidentyfikuj neurony ruchowe wyrażające bioczujnik poprzez wzbudzenie monomerycznej Umikinoko-Green za pomocą 488-nanometrowego lasera argonowego. Następnie ustaw jego emisję w zakresie od 495 do 525 nanometrów i naciśnij Nagrywaj.
Aby uzyskać pomiar FRET, wzbudz mUKG, dawcę pary FRET, za pomocą lasera 488-nanometrowego. Równocześnie, za pomocą dwóch fotopowielaczy, wykryj fluorescencję emitowaną przez donor oraz fluorescencję emitowaną przez monomeryczny akceptor Kusabira-Orange. Na początku eksperymentu zoptymalizuj wzmocnienie i przesunięcie fotopowielacza 1, w którym rejestrowana jest fluorescencja mUKG, i utrzymuj je na stałym poziomie przez całą sesję.
Aby ustawić przesunięcie, zmień kolor obrazu na wartości intensywności, korzystając z tabeli Q-lookup. Podczas skanowania z wyłączonym laserem użyj suwaka przesunięcia, aby piksele tła miały intensywność nieco wyższą od zera. Korzystając z tej samej tabeli przeglądowej, włącz laser. Podczas skanowania użyj suwaka wzmocnienia, aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu, uważając, aby uniknąć nasyconych pikseli.
W oknie akwizycji oprogramowania wybierz tryb akwizycji xyt i rozmiar pola obrazu 512 na 64 piksele z menu rozwijanego. Następnie ustaw zapis zmian napięcia neuronu rdzeniowego zarodka tak, aby uzyskać pojedynczą płaszczyznę xy co 30 milisekund przez jedną minutę. Oceń wpływ podawania riluzolu na depolaryzację błony w tym samym neuronie, uzyskaj nowy zestaw danych pięć minut po dodaniu wody rybnej zawierającej 5 mikromolowych riluzolów.