Monitorowanie sygnałów elektrycznych z neuronów aferentnych w unieruchomionej larwie danio pręgowanego

Zacznij od unieruchomionej, sparaliżowanej larwy danio pręgowanego w komorze rejestracyjnej wypełnionej roztworem zewnątrzkomórkowym w konfiguracji elektrofizjologicznej.

Napełnij mikropipetę aferentną roztworem zewnątrzkomórkowym zawierającym jony, które zapewniają przewodnictwo elektryczne w celu rejestrowania aktywności neuronalnej.

Zmontuj go w mikromanipulator zawierający elektrodę rejestrującą podłączoną do amplifier w celu nagrywania sygnału.

Zastosuj dodatnie ciśnienie powietrza, aby zapobiec zatkaniu pipety.

Przesuń końcówkę pipety wzdłuż nerwu linii bocznej i umieść ją w sąsiedztwie zwoju aferentnego, który zawiera skupisko aferentnych ciał komórek nerwowych.

Procesy komórkowe tych neuronów są połączone z komórkami rzęsatymi znajdującymi się wzdłuż linii bocznej, które wyczuwają ruchy wody.

Następnie zastosuj delikatne podciśnienie, aby utworzyć luźne uszczelnienie między mikropipetą a zwojem doprowadzającym.

Rejestruj sygnały elektryczne z neuronów aferentnych, które odbierają bodźce czuciowe z komórek rzęsatych w unieruchomionej larwie.

Unieruchomić larwy danio pręgowanego i przenieść je na 35-milimetrową szalkę Petriego za pomocą pipety transferowej z dużą końcówką. Usuń jak najwięcej otaczającego roztworu. Zanurz larwy w 10 mikrolitrach 0,1% alfa bungarotoksyny na około pięć minut. Płucz sparaliżowaną larwę roztworem zewnątrzkomórkowym przez 10 minut. Następnie za pomocą pipety transferowej przenieś larwę z kąpieli z roztworem zewnątrzkomórkowym do naczynia rejestrującego z silikonowym dnem.

Pod mikroskopem stereoskopowym delikatnie umieść larwy za pomocą kleszczyków z cienką końcówką powyżej środka maty silikonowej, boczną stroną do góry, z przednimi i tylnymi końcami ciała biegnącymi od lewej do prawej. Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką włóż wytrawioną szpilkę prostopadle do silikonu przez grzbietową strunę grzbietową larw, bezpośrednio grzbietowo do odbytu. Włóż drugą szpilkę przez strunę grzbietową w pobliżu końca ogona, a trzecią szpilkę włóż przez grzbiet struny grzbietowej pęcherza gazowego. Włóż czwartą szpilkę przez pęcherzyk uszny, zapewniając lekki obrót, gdy szpilka wkłada się do kapsułki.

Po zastosowaniu lekkiej rotacji obserwuj, czy tkanka między cleithrum a pęcherzykiem usznym ujawnia skupisko somatów doprowadzających. Umieść przypiętą lawę pod 10-krotnym obiektywem na stałym stoliku mikroskopu DIC i ustaw szczeliny mięśniowe bloków mięśniowych równolegle do wektora lewego stopnia głowy.

Umieść przewód uziemiający w roztworze wanny i upewnij się, że jest podłączony do lewej głowicy stage. Napełnij aferentną elektrodę rejestrującą 30 mikrolitrami roztworu zewnątrzkomórkowego i włóż ją do prawego uchwytu na pipetę stopnia głównego. Następnie zanurz go w roztworze naczynia, stosując nadciśnienie wytwarzane przez przetwornik pneumatyczny.

Zlokalizuj elektrodę i przesuń końcówkę elektrody nad próbką. Za pomocą mikromanipulatora opuść końcówkę elektrody doprowadzającej, aż utrzyma się nad cleithrum. Zwiększ powiększenie do 40-krotnego zanurzenia i zlokalizuj przecięcie tylnej linii bocznej nerwu i cleithrum. Umieść końcówkę elektrody nad zwojem doprowadzającym i opuść pipetę, aż końcówka zetknie się z nabłonkiem. Delikatnie manewruj elektrodą tak, aby cały obwód końcówki stykał się ze zwojem doprowadzającym.