Rejestrowanie oscylacji pasma gamma z neuronów jądra szypułkowego w wycinku mózgu

Zacznij od konfiguracji elektrofizjologicznej z strzałkową częścią mózgu zanurzoną w CSF zawierającym blokery synaptyczne.

Ta sekcja zawiera bogaty w neurony region PPN.

Blokery synaptyczne hamują różne neuronalne receptory pobudzające i hamujące oraz błonowe kanały sodowe, zapobiegając ich zakłóceniom.

Napełnij pipetę krosową roztworem bogatym w potas i włóż ją do uchwytu podłączonego do elektrody rejestrującej i wzmacniacza.

Zastosuj dodatnie ciśnienie powietrza do pipety, aby zapobiec zatkaniu, a następnie umieść ją w pobliżu neuronu PPN.

Zastosuj ssanie ujemne, aby utworzyć szczelne uszczelnienie z błoną neuronową i kontynuuj to ssanie, aż błona pęknie.

Dostarcz dodatnie impulsy prądu, aby otworzyć kanały wapniowe zależne od napięcia, umożliwiając wejście jonów wapnia.

Powoduje to oscylacje pasma gamma, wzbudzenie niskiego poziomu, które jest niezbędne do czuwania bez pełnego pobudzenia neuronów.

Rejestruj te sygnały za pomocą pipety rejestrującej, aby monitorować oscylacje pasma gamma.

W tej procedurze przenieś plasterek do komory zanurzeniowej, umieść na nim sitko, aby przytrzymać plasterek w dół, i perfuzuj go z prędkością 1,5 mililitra na minutę, z natlenionym aCSF zawierającym wybranego antagonistę receptora.

Aby wyizolować wewnętrzne właściwości błony, musisz zablokować szybką transmisję synaptyczną wokół komórki, a także zablokować zdolność do generowania potencjałów czynnościowych. Musisz więc użyć blokerów synaptycznych i tetrodotoksyny lub TTX, aby zablokować potencjały czynnościowe. W ten sposób komórka, którą łatasz, jest tą, która generuje te właściwości i nie jest za to odpowiedzialny żaden sygnał synaptyczny, i to jest to, co tutaj badamy - wewnętrzne właściwości błony.

Następnie napełnij pipetę z plastrem rejestrującym wewnątrzkomórkowym roztworem o wysokiej zawartości potasu. Włóż pipetę do uchwytu stopnia głowicy. Następnie zastosuj niewielkie nadciśnienie za pomocą 1-mililitrowej strzykawki podłączonej do uchwytu na pipety. Używając obiektywu 4x wraz z interferencyjną optyką kontrastową w bliskiej podczerwieni, zlokalizuj jądro PPN, które znajduje się grzbietowo w stosunku do górnej szypułki móżdżku.

Powoli opuść pipetę rejestrującą do jądra PPN za pomocą mikromanipulatora mechanicznego. Następnie umieścić pipetę rejestrującą w PPN pars compacta, która znajduje się bezpośrednio grzbietowo do tylnego końca szypułki. Używając soczewki z 40-krotnym zanurzeniem w wodzie, doprowadź pipetę rejestrującą do kontaktu z neuronem PPN i szybko zastosuj ujemne ssanie, aby utworzyć uszczelnienie z komórką.

Użyj oprogramowania do uszczelniania zacisków napięciowych, aby monitorować rezystancję pipety podczas ssania ujemnego. Następnie powoli zwiększaj podciśnienie. Gdy wartość rezystancji pipety osiągnie od 80 do 100 megaomów, szybko zmień potencjał utrzymywania na minus 50 miliwoltów i uwolnij podciśnienie.

Stosuj podciśnienie w sposób ciągły, aż błona komórkowa zostanie pęknięta i uzyskany zostanie dostęp elektryczny w konfiguracji całego ogniwa. Przed odsysaniem opór jest niski. W tym przypadku 2,5 megaoma. W miarę stosowania ssania amplituda kroku zmniejsza się w kierunku trzymania. Po uformowaniu uszczelki zwróć uwagę, że rezystancja wzrasta do 167 megaomów.

Przy dodatkowym ssaniu powstaje gigaseal. Rezystancja na krótko wzrasta do 1,2 gigaoma przed uzyskaniem dostępu do całej komórki. Stale monitoruj spoczynkowy potencjał błonowy rejestrowanego neuronu PPN. Jeśli spoczynkowy potencjał błony przesuwa się w kierunku wartości depolaryzacyjnych lub hiperpolaryzacyjnych, należy zastosować niewielką ilość prądu stałego, aby utrzymać optymalny potencjał na poziomie minus 50 miliwoltów.