Optyczny zapis aktywności neuronalnej w wycinkach mózgu barwionych barwnikiem wrażliwym na napięcie

Weźmy unieruchomiony wycinek mózgu myszy wybarwiony barwnikiem wrażliwym na napięcie lub VSD, cząsteczkami fluorescencyjnymi, które integrują się z błoną neuronalną i reagują na zmiany potencjału błonowego.

Umieść plasterek w komorze nagrywającej.

Zamontuj elektrodę uziemiającą dla napięcia odniesienia do linii bazowej.

Następnie umieść elektrody stymulujące i rejestrujące na plastrze.

Zastosuj impuls elektryczny.

Impuls stymuluje neurony, wywołując bramkowane napięciem otwarcie kanału sodowego i napływ jonów sodu, co prowadzi do zmiany potencjału błonowego.

Powoduje to indukcję potencjału czynnościowego, mierzonego przez elektrodę rejestrującą, i zmienia właściwości fluorescencyjne VSD.

Wystaw wycinek mózgu na działanie określonej długości fali, aby wzbudzić VSD i wywołać emisję fluorescencji.

Po stymulacji kanały sodowe zamykają się, podczas gdy kanały potasowe bramkowane napięciem otwierają się, sprzyjając odpływowi jonów potasu.

To ponownie zmienia potencjał błony, a w konsekwencji zmienia fluorescencję VSD.

Rejestruj fluorescencję w czasie rzeczywistym, aby wizualnie reprezentować aktywność neuronalną.

Aby rozpocząć tę procedurę, włącz amplifier, komputer i system kamer oraz otwórz oprogramowanie. Wlej CSF do 50-mililitrowej probówki i bąbelkuj go karbogenem. Użyj pompy perystaltycznej do cyrkulacji aCSF i dostosuj natężenie przepływu do około jednego mililitra na minutę.

Następnie wyreguluj wysokość pipety ssącej tak, aby poziom cieczy w komorze doświadczalnej był zawsze stały. Umieść elektrodę masową w komorze. Następnie napełnij szklaną elektrodę niewielką ilością aCSF i umieść ją w uchwycie elektrody. Przymocuj uchwyt do pręta manipulatora.

Korzystając ze wzmacniacza, upewnij się, że rezystancja elektrody wynosi około 1 megaoma. Podczas sesji nagraniowej przenieś plaster z komory wilgotnej do komory eksperymentalnej. Mocno dociśnij krawędź pierścienia do silikonowego O-ringu. Uważaj, aby nie naruszyć membrany ani dna komory doświadczalnej.

Pod mikroskopem umieść końcówkę elektrody stymulującej i elektrodę rejestrującą potencjał pola na plasterku. Sprawdź wywołaną reakcję, dostarczając bodziec. Upewnij się, że pole widzenia obejmuje prawy obwód neuronowy w optycznym systemie zapisu.

Następnie dostosuj natężenie światła wzbudzenia na około 70% do 80% maksymalnej pojemności kamery. Korzystając z fluorescencyjnego źródła światła, wyreguluj ostrość za pomocą systemu akwizycji. Następnie rozpocznij nagrywanie i przeanalizuj dane w oprogramowaniu do akwizycji obrazu po akwizycji.