Badanie elektrofizjologiczne synaps retinogenikulacyjnych i kortykopochodnych w wycinkach mózgu myszy

Umieść wycinek mózgu myszy w komorze nagraniowej wypełnionej natlenionym roztworem nagrywającym.

Wycinek zawiera grzbietowe boczne jądro kolankowate lub dLGN, które jest bogate w neurony przekaźnikowe. Neurony te tworzą synapsy retinogenikulacyjne z wypustkami komórek zwojowych siatkówki i synapsy kortykogenne z projekcjami neuronalnymi z kory wzrokowej.

Umieść pipetę stymulującą na przewodzie wzrokowym, aby zbadać synapsy retinogenikulacyjne lub na jądrze reticularis thalami, aby zbadać synapsy kortykogeniczne.

Umieść pipetę rejestrującą w pobliżu plasterka. Za pomocą mikroskopu zlokalizuj neuron przekaźnikowy.

Zastosuj nadciśnienie, aby zapobiec zatkaniu pipety podczas zbliżania się do neuronu.

Przełącz się na podciśnienie, tworząc uszczelnienie z błoną komórkową, a następnie rozerwij ją, aby ustanowić ciągłość z cytoplazmą.

Za pomocą pipety stymulującej dostarczaj impulsy elektryczne, które indukują projekcje do uwalniania pobudzających neuroprzekaźników, które wiążą się z receptorami synaptycznymi neuronów przekaźnikowych, wyzwalając przepływ jonów mierzony przez pipetę rejestrującą.

W tej procedurze należy wyciągnąć pipety rejestrujące za pomocą kapilar ze szkła borokrzemianowego i ściągacza do filamentu. Następnie pociągnij pipety stymulujące zgodnie z tym samym protokołem, ale po pociągnięciu lekko złamij końcówkę, aby zwiększyć średnicę. Następnie napełnij pipety rejestrujące roztworem wewnątrzkomórkowym i biocytyną, a pipety stymulujące napełnij roztworem nagrywającym.

Następnie umieść plastry w komorze nagrywającej i kontynuuj je perfuzją natlenionego roztworu nagrywającego w temperaturze pokojowej. Wizualizacja plastrów za pomocą mikroskopu pionowego wyposażonego w mikroskopię wideo IR-DIC. Sprawdź wszystkie plasterki i wybierz te, które mają nienaruszone drogi wzrokowe. Umieść pipetę stymulującą na plasterku przed załataniem komórki pipetą rejestrującą.

Aby zbadać synapsy retinogenikulatu, umieść pipetę stymulującą bezpośrednio na przewodzie wzrokowym, w którym znajdują się włókna aksonowe z komórek zwojowych siatkówki. Aby przeanalizować synapsy kortykogeniczne, umieść elektrodę stymulującą na jądrze wzgórza reticularis, które przylega rostrobrzusznie do grzbietowo-bocznego jądra kolankowatego. Po zanurzeniu pipety rejestrującej w roztworze do nagrywania należy zastosować pięciomiliwoltowy krok, aby monitorować opór pipety.

Ustaw potencjał podtrzymania na zero miliwoltów i anuluj potencjał przesunięcia tak, aby prąd podtrzymania wynosił zero pikoamperów. Zbliżyć się do celi z pipetą rejestrującą, stosując nadciśnienie. Gdy pipeta ma bezpośredni kontakt z błoną komórkową, zwolnij nadciśnienie i ustaw potencjał utrzymywania na minus 70 miliwoltów.

Następnie należy zastosować lekkie podciśnienie, aby błona komórkowa mogła przymocować się do szklanej pipety w taki sposób, aby utworzyło się uszczelnienie gigaomowe. Skompensuj pojemność pipety i otwórz celę, stosując impulsy podciśnienia. Aby zbadać funkcję synaptyczną, zastosuj 0,1-milisekundowe impulsy prądu za pomocą pipety stymulującej. Monitoruj rezystancję szeregową w sposób ciągły, stosując krok pięciomiliwoltowy.

Rezystancję szeregową można oszacować, dzieląc pięć miliwoltów przez szczytową amplitudę wywołanego prądu. Do analizy należy używać tylko ogniw o rezystancji szeregowej mniejszej niż 20 megaomów.