Fotostymulacja i zapisy klamer całokomórkowych neuronów w wycinkach hipokampa myszy

Weźmy unieruchomiony, transfekowany wycinek mózgu myszy w komorze rejestrującej elektrofizjologię wypełnioną natlenionym aCSF.

Ten wycinek zawiera zakończenia aksonów neuronów wzgórzowych wyrażające światłoczułe kanały jonowe połączone z białkiem fluorescencyjnym.

Wizualizuj fluorescencyjne aksony neuronów wzgórzowych i wybierz neuron piramidowy.

Przesuń pipetę rejestrującą zawierającą elektrodę w roztworze wewnątrzkomórkowym w kierunku wybranego neuronu z lekkim dodatnim ciśnieniem.

Dodatnie ciśnienie tworzy wgłębienie w błonie neuronalnej w kontakcie.

Zwolnij ciśnienie, aby utworzyć uszczelnienie o wysokiej wytrzymałości.

Ustaw potencjał membrany na stałą wartość ujemną.

Zastosuj impuls podciśnienia, aby rozerwać membranę, uzyskując konfigurację całej komórki.

Oświetl zakończenia aksonów, aktywując kanały wrażliwe na światło i depolaryzując błony neuronalne, wyzwalając potencjały czynnościowe.

Uwalniane są neuroprzekaźniki pobudzające, wiążące się z receptorami na zarejestrowanym neuronie, powodując napływ kationów.

Zapisz powstałe pobudzające prądy postsynaptyczne, wskazujące na bezpośrednie połączenie synaptyczne między neuronami.

Aby wykonać zapis z użyciem klamry kroskowej dla całej komórki, delikatnie przenieś wycinek mózgu zawierający kompleks hipokampa do komory rejestracyjnej. Ciągle perfunduj komorę nagraniową za pomocą ACSF o temperaturze 34 stopni Celsjusza bąbelkowanej karbogenem z prędkością od 2 do 3 mililitrów na minutę. Pokrótce zbadaj ekspresję GFP chronos w końcówkach aksonów w obszarze zainteresowania z niebieskim podświetleniem LED przy 4-krotnym powiększeniu.

Zmień obiektyw na 63-krotny zanurzenie i wyreguluj ostrość. Sprawdź, czy w aksonach występuje ekspresja Chronos GFP i wybierz neuron piramidowy do rejestracji łaty. Następnie napełnij pipetę wewnętrznym roztworem na bazie glukonianu potasu. Zamontuj go w uchwycie na pipety na stoliku pod głowicę. Załataj ogniwo w konfiguracji cęgów napięciowych.

Zbliż się do zidentyfikowanego neuronu i delikatnie dociśnij końcówkę pipety do somy. Nadciśnienie powinno wytworzyć wgłębienie na powierzchni membrany. Następnie zwolnij ciśnienie, aby utworzyć uszczelnienie giga omów. Po uszczelnieniu ustaw napięcie podtrzymania na minus 65 miliwoltów.

Przerwij membranę ostrym impulsem podciśnienia. Zapis w cęgach prądowych lub napięciowych postsynaptycznych odpowiedzi na 475-nanometrową stymulację całego pola LED włókien doprowadzających wyrażających chronos. Stymuluj ciągami po 10 stymulacji o czasie trwania 2 milisekund przy 20 hercach.