Jednoczesne optyczne i elektrofizjologiczne monitorowanie komórek neuronalnych w wycinkach mózgu

Zacznij od perfuzji napowietrzonego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego lub aCSF przez siatkę w komorze perfuzyjnej.

Przenieś wycinek mózgu zawierający neurony wykazujące ekspresję białka fluorescencyjnego i zakotwicź go za pomocą urządzenia z platynowym przewodem.

Obróć siatkę siatki w celu wyrównania.

Opuść sondę wielokanałową w kierunku wycinka.

Dostosuj kostkę filtra do wizualizacji białek fluorescencyjnych.

Obróć plasterek, aby wyrównać sondę.

Dostosuj wysokość sondy poniżej powierzchni tkanki.

Teraz wykonaj perfuzję aCSF i skup się na fluorescencyjnie znakowanych neuronach.

Używając obiektywu o dużej mocy, skup się na tkance i wyreguluj światło wzbudzenia.

Użyj odpowiedniego filtra światła, aby zaobserwować fluorescencję w neuronach.

Wyreguluj soczewkę obiektywu, aby zrobić miejsce na pipetę z plastrem i zastosuj nadciśnienie.

Następnie umieść pipetę w pobliżu neuronu, aby utworzyć wgłębienie błony.

Na koniec zastosuj słabe ssanie, aby utworzyć uszczelnienie membrany, a następnie silne ssanie, aby przerwać membranę i uzyskać nagrania elektryczne z docelowego neuronu.

Aby umieścić sondę wielokanałową w szkiełku tkanki mózgowej ex vivo, perfuse eksperymentalny ACSF z pęcherzykami w tempie od trzech do sześciu mililitrów na minutę i przenieś wycinek mózgu zawierający obszar zainteresowania na siatkę w komorze perfuzyjnej mikroskopu. Zakotwicz wycinek mózgu za pomocą platynowej harfy. Obróć siatkę tak, aby linia styków elektrod na dystalnym końcu sondy wielokanałowej była w przybliżeniu prostopadła do powierzchni PL.

Przy szerokim oświetleniu i precyzyjnej kontroli mikromanipulatora opuść sondę wielokanałową w kierunku powierzchni warstwy. Włącz odpowiednią kostkę filtrującą do wizualizacji fluorescencyjnego białka reporterowego ulegającego ekspresji w zakończeniach aksonów aferentów korowych.

W razie potrzeby obróć plasterek, aby dokładniej wyrównać sondę z powierzchnią PL. Umieść sondę tuż nad płaszczyzną wycinka, 200 mikrometrów przed ostateczną pozycją docelową wzdłuż osi x, pozostawiając co najmniej jeden kanał poza obszarem rejestrowanej tkanki. Powoli włóż sondę do plastra wzdłuż jego osi podłużnej.

Aby zminimalizować uszkodzenia tkanki, przesuwaj sondę tylko do tego stopnia, aby ostre końcówki były widoczne tylko pod powierzchnią tkanki. Przełącz eksperymentalne źródło ACSF na workowany roztwór kontrolny i zidentyfikuj fluorescencyjnie znakowaną komórkę w celu ukierunkowanego zapisu patch-clamp. Ogranicz przysłonę do najmniejszej średnicy i włącz obiektyw zanurzeniowy o dużej mocy, uważając, aby uniknąć kontaktu między sondą wielokanałową a soczewką obiektywu. Ustaw ostrość na tkance.

Wyśrodkuj światło na obszarze tkanki przylegającym do sondy wielokanałowej, ale nie nakładającym się na nią. Włącz odpowiedni zestaw filtrów, aby umożliwić obrazowanie komórek wyrażających marker fluorescencyjny zależny od Cre. Podnieś soczewkę obiektywu, aby uzyskać wystarczająco dużo miejsca na opuszczenie pipety z plastrem.

Załadować pipetę krosową roztworem wewnętrznym i zamontować ją na uchwycie elektrody. Użyj strzykawki o pojemności jednego mililitra, aby zastosować nadciśnienie odpowiadające około 0,1 mililitra powietrza. Zanurz pipetę z plastrem w roztworze, ustawiając ostrość końcówki pod kierunkiem wizualnym i uzyskaj zapis całej komórki z docelowej komórki.