Określanie testowego wpływu hormonu wzrostu na neurony kisspeptyny za pomocą zacisku łatkowego dla całych komórek

Zabezpiecz wycinek podwzgórza transgenicznej myszy w komorze rejestracyjnej wypełnionej płynem CSF.

Wycinek zawiera fluorescencyjne neurony kisspeptyny wyrażające białko fuzyjne, kluczowe dla regulacji układu rozrodczego.

Umieścić mikropipetę składającą się z elektrody rejestrującej w roztworze wewnętrznym.

Mikroskopowo zlokalizuj fluorescencyjny neuron kisspeptyny.

Zastosuj dodatni nacisk na pipetę i przesuń ją w kierunku docelowego neuronu. W kontakcie ciśnienie tworzy wgłębienie w błonie neuronalnej.

Zastosuj krótkie podciśnienie, tworząc uszczelnienie o wysokiej rezystancji między mikropipetą a membraną.

Ustaw napięcie utrzymywania na fizjologicznym potencjale spoczynkowym neuronu, aby uzyskać dokładne pomiary.

Zastosuj krótkie impulsy podciśnienia, aby przełamać membranę, ustanawiając konfigurację całego ogniwa.

Potwierdź żywotność neuronu, monitorując parametry.

Wprowadź testowy hormon wzrostu, wyzwalając szlaki sygnałowe i wywołując zmiany w potencjale błonowym neuronu.

Zmierz zmiany w potencjale błony, aby określić hamujący wpływ hormonu wzrostu na aktywność neuronów.

Przenieś interesujący Cię wycinek mózgu, pojedynczo, do komory nagraniowej za pomocą akrylowej pipety transferowej. Przytrzymaj plasterek za pomocą kotwicy plasterka, aby nie poruszał się podczas perfuzji CSF. Umieść plasterek na środku komory nagrywającej za pomocą soczewki obiektywowej mikroskopu immersyjnego o małej mocy 10x lub 20x.

Pozycja warstwy ma kluczowe znaczenie, aby umożliwić dobry widok żądanego obszaru pod mikroskopem i zapewnić idealne sięgnięcie do mikropipety rejestrującej. Po zlokalizowaniu obszaru zainteresowania zmień soczewkę obiektywu na soczewkę o dużej mocy, 63x, i skup się na poziomie tkanki, obserwując endogenne białko fluorescencyjne i kształty komórek w regionie docelowym, aby zlokalizować komórki kisspeptyny na powierzchni wycinka mózgu.

Gdy znajduje się możliwa komórka docelowa, zaznacz ją na ekranie komputera kursorem myszy lub rysując format taki jak kwadrat nad obszarem zainteresowania. Oznaczony ekran komputera pomaga wskazać pozycję mikropipety rejestrującej do celi. Po ustaleniu dokładnej lokalizacji celi docelowej należy podnieść obiektyw i wprowadzić mikropipetę rejestrującą wypełnioną roztworem wewnętrznym do uchwytu elektrody, upewniając się, że roztwór wewnętrzny styka się ze srebrną elektrodą.

Przed zanurzeniem mikropipety w roztworze aCSF należy zastosować nadciśnienie za pomocą strzykawki wypełnionej powietrzem o pojemności od 1 do 3 mililitrów, połączonej z uchwytem mikropipety za pomocą rurki polietylenowej, aby zapobiec przedostawaniu się zanieczyszczeń do mikropipety. Za pomocą mikromanipulatora poprowadź mikropipetę poniżej środka obiektywu. Przesuń przyciski mikromanipulatora, aby poprowadzić osie x, y i z mikropipety w kierunku celi zainteresowania.

Dostosuj ostrość tak, aby widzieć końcówkę mikropipety i zbliż ostrość, ale nie za blisko plasterka. Zmniejsz prędkość mikropipety i powoli opuść mikropipetę do płaszczyzny ostrości, upewniając się, że końcówka mikropipety nie wnika gwałtownie w plasterek, ale powoli opada, aż dotknie powierzchni komórki lub obszaru docelowego.

Stosując lekkie nadciśnienie za pomocą strzykawki wypełnionej powietrzem o pojemności od 1 do 3 mililitrów, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia ze ścieżki podejścia, powoli przesuń mikromanipulator na osi x, y, z, aby zbliżyć końcówkę mikropipety i dotknąć komórki docelowej, co powoduje wgłębienie pod wpływem przyłożonego ciśnienia. Po ustaleniu wgłębienia, za pomocą trybu zacisku napięcia w oprogramowaniu, zastosuj słabe, krótkie ssanie doustnie przez 1 do 2 sekund przez rurkę podłączoną do uchwytu mikropipety, aby wytworzyć uszczelnienie między mikropipetą a celą.

Jeśli uszczelnienie pozostaje stabilne mechanicznie bez zakłóceń hałasu przez około minutę, ustaw napięcie podtrzymania na najbliższy fizjologiczny potencjał spoczynkowy interesującego ogniwa. W przypadku neuronów podwzgórza kisspeptyny zaleca się minus 50 miliwoltów. Następnie należy zastosować krótkie ssanie doustne, aby przerwać błonę plazmatyczną na końcówce mikropipety uszczelnionej umieszczonej na komórce, tak aby pęknięta błona nie zatkała mikropipety ani nie przyciągnęła znacznej części błony lub komórki.

Odpowiednią konfigurację całej komórki można uzyskać, wykonując ssanie z wystarczającą siłą. Sprawdź używaną instrukcję ustawień systemowych. Po przerwaniu błony komórkowej włącz opcję Whole Cell w trybie cęgów napięciowych i kliknij polecenie auto odnoszące się do zakładki Whole Cell.

Następnie sprawdź parametry żywotności komórek w oprogramowaniu zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Monitoruj rezystancję serii i pojemność ogniw w stanie ustalonym podczas eksperymentów. Po prawidłowym osiągnięciu konfiguracji całego ogniwa zmierz prądy synaptyczne w trybie cęgów napięciowych. Rejestruj zmiany spoczynkowego potencjału błonowego i indukowane zmiany spoczynkowego potencjału błonowego w bieżącym trybie cęgowania.