Zapis klamry krosowej całej komórki w neuronie istoty żelatynowej wycinka rdzenia kręgowego

Umieść wycinek rdzenia kręgowego szczura w komorze rejestracyjnej i zabezpiecz go kotwicą tkankową.

Perfuzjuj plasterek sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym.

Pod mikroskopem zidentyfikuj półprzezroczystą istotę żelową lub region SG i wybierz zdrowy neuron SG.

Umieść pipetę z plastrem wypełnionym roztworem jonowym w pobliżu neuronu.

Zastosuj łagodne nadciśnienie, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia z końcówki pipety.

Przesuń pipetę w kierunku neuronu.

Następnie zwolnij dodatnie ciśnienie, aby utworzyć wgłębienie na błonie neuronalnej, tworząc uszczelnienie.

Zmień potencjał utrzymywania, aby zbliżyć go do spoczynkowego potencjału błonowego lub RMP.

Użyj krótkiego ssania, aby rozerwać membranę, ustanawiając konfigurację całej komórki.

Przy RMP zastosuj depolaryzujące impulsy elektryczne.

Impulsy te otwierają kanały sodowe bramkowane napięciem, umożliwiając szybki napływ jonów sodu.

Ten napływ jonów wyzwala potencjał czynnościowy, co skutkuje wypalaniem neuronów.

Rejestruj wzorce wypalania neuronów.

Aby przeprowadzić zapisy całokomórkowe patch-clamp z neuronów istoty żelowej lub SG, do rejestracji należy użyć roztworów wewnątrzkomórkowych na bazie jonów potasu, stosując roztwór na bazie kationu cezu tylko do rejestracji hamujących prądów postsynaptycznych.

Delikatnie przesuń plasterek rdzenia kręgowego do komory nagrywania, a następnie mocno ustabilizuj go platynowym drutem w kształcie litery U z nylonowymi gwintami, aby zapewnić optymalną stabilność cięcia. Równomiernie perfunduj plasterek za pomocą bąbelkowego ACSF w temperaturze pokojowej i ustaw szybkość perfuzji na 2 do 4 mililitrów na minutę, aby uzyskać wystarczające natlenienie.

Następnie, używając soczewki mikroskopu o niskiej rozdzielczości, zidentyfikuj obszar neuronów SG jako półprzezroczyste pasmo. Wybierz zdrowy neuron, charakteryzujący się trójwymiarowym kształtem z jasną i gładką błoną, jako komórkę docelową, korzystając z obiektywu o wysokiej rozdzielczości i dostosuj go do środka ekranu monitora wideo.

Napełnij mikropipetę odpowiednią objętością roztworu wewnątrzkomórkowego na bazie jonów potasu lub cezu. Następnie włóż mikropipetę do uchwytu elektrody i upewnij się, że roztwór wewnątrzkomórkowy styka się ze srebrnym drutem wewnątrz uchwytu. Ustaw ostrość mikropipety i zanurz ją w ACSF za pomocą mikromanipulatora. Zastosuj łagodne nadciśnienie, aby usunąć wszelkie zabrudzenia i zanieczyszczenia.

Stopniowo przesuwaj mikropipetę w kierunku docelowego neuronu. Gdy pipeta zbliży się do neuronu, a na błonie neuronalnej utworzy się bardzo mały wgłębienie, zwolnij dodatnie ciśnienie, aby utworzyć gigaseal. Zmień potencjał utrzymywania na minus 70 miliwoltów, co jest bliskie fizjologicznemu potencjałowi spoczynkowemu błony komórki.

Następnie zastosuj przejściowe i delikatne ssanie do mikropipety, aby rozerwać membranę i stworzyć dobrą konfigurację całych komórek. Rejestruj właściwości wypalania, testując wzorzec wypalania każdego neuronu w cęgach prądowych za pomocą serii jednosekundowych impulsów prądu depolaryzującego o natężeniu od 25 do 150 pikoamperów z przyrostami 25 pikoamperów przy spoczynkowym potencjale błony.