JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:18 min. • July 8th, 2025
Zacznij od wypreparowanej małżowiny usznej myszy lub ucha zewnętrznego, z odsłoniętymi połączonymi nerwami.
Włożyć nerw przeznaczony do nagrywania do elektrody rejestrującej.
Usuń warstwę tłuszczu w pobliżu brzegu małżowiny usznej, aby odsłonić podstawę mieszków włosowych, a następnie złóż skórę, aby odsłonić włosy do stymulacji.
Ustaw sondę do stymulacji mechanicznej tak, aby dotykała i odchylała włosy.
Stymulacja ta aktywuje zakończenia nerwów czuciowych, otwiera mechanicznie bramkowane kanały jonowe, umożliwia napływ jonów dodatnich i generuje potencjały czynnościowe.
Potencjały czynnościowe rozchodzą się przez te zakończenia do rejestrowanego nerwu. Wizualizacja sygnału.
Następnie dodaj farbę fluorescencyjną i kontynuuj stymulację włosów.
Barwnik wiąże się ze stymulowanymi błonami neuronalnymi i jest internalizowany przez endocytozę bez wpływu na aktywność neuronów.
Po stymulacji umyj, aby usunąć niezwiązany barwnik.
Dodaj środek sekwestracyjny, aby usunąć nieinternalizowany barwnik związany z błoną.
Za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej uwidocznij przebarwienia w mieszkach włosowych, aby zidentyfikować mechanicznie stymulowane zakończenia nerwowe.
Aby dokonać kontrolowanych zapisów potencjałów czynnościowych wywołanych bodźcem, należy użyć sondy mechanicznej z polerowanego ogniowo 10-centymetrowego szkła mikroelektrodowego borokrzemianowego, podłączonej do ceramicznego siłownika piezoelektrycznego. Ustaw sondę tak, aby poruszała się równolegle do fałdu skórnego i dotykała włosów, a nie skóry. Umieść go około pół do jednego milimetra nad powierzchnią skóry. Następnie ręcznie zweryfikuj stymulację, nasłuchując wyjścia audio, gdy sonda się porusza.
Teraz skonfiguruj oprogramowanie, aby sterować mechaniczną stymulacją małego obszaru włosów. Na przykład zaprogramuj trzysekundowe stymulacje przy pięciu sinusoidach Hertz co 10 sekund. Wymaga to przemieszczenia sondy w zakresie od 200 do 2000 mikronów. Następnie kontynuuj powtarzaną automatyczną stymulację, aby sprawdzić spójność zarejestrowanych reakcji w nerwach. Powtarzalne wyniki powinny być osiągalne.
Gdy wyniki są spójne, zmniejsz częstotliwość powtarzania do co 30 sekund. Dalsze instrukcje znajdują się w protokole tekstowym. Aby zbadać właściwości kanałów mechanosensorycznych i oznaczyć zakończenia mechanosensoryczne wokół mieszków włosowych, dodaj 10 mikromolowych FM143 do roztworu i pozostaw na 60 minut, kontynuując stymulację włosów za pomocą sondy oscylacyjnej.
Barwnik ten blokuje potencjalne kanały przetwornikowe w neuronach czuciowych w hodowli i w komórkach rzęsatych ślimaka. Nie blokuje jednak wypalania w dojrzałych włosach włosowych aferentów in situ. Oznakowanie końcówek pokazuje, że barwnik działa jak końcówki, które nadal reagują na stymulację mechaniczną podczas ekspozycji na barwnik.