Hamowanie pobudzających prądów postsynaptycznych za pośrednictwem mikroRNA w mysich wycinkach hipokampa

Weźmy mysie wycinki mózgu hipokampa zawierające neurony CA3 zakażone rekombinowanym wektorem wirusowym.

Genom wirusa wyraża aktywowany światłem kanał oznaczony fluorescencyjnym reporterem i mikroRNA, który obniża ekspresję kanałów wapniowych bramkowanych napięciem.

Umieść plasterek w komorze nagraniowej w ciemnych warunkach. Za pomocą mikroskopu zidentyfikuj fluorescencyjne neurony CA3.

Umieść elektrodę rejestrującą na neuronie CA1, który otrzymuje dane wejściowe z zainfekowanych neuronów CA3. Rozerwij membranę, aby zarejestrować wewnątrzkomórkowe prądy jonowe.

Zastosuj inhibitor, aby zablokować hamujące receptory neuroprzekaźników, dopuszczając tylko sygnały pobudzające.

Za pomocą impulsów świetlnych stymuluj aktywowane światłem kanały w zainfekowanych neuronach CA3, generując potencjały czynnościowe.

U niezakażonych myszy potencjał czynnościowy aktywuje kanały wapniowe bramkowane napięciem, powodując napływ jonów wapnia, który wyzwala uwalnianie neuroprzekaźników. Neuroprzekaźniki wyzwalają pobudzające prądy postsynaptyczne lub EPSC w neuronach CA1.

U zakażonych myszy redukcja kanałów wapniowych bramkowanych napięciem za pośrednictwem mikroRNA powoduje hamowanie EPSC.

Do tego protokołu należy użyć zwierzęcia, któremu 15 dni wcześniej lub dłużej wstrzyknięto rAAV1/2 do mózgu, zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem przez Cetin i spółkę. Wyizoluj mózg i wykonaj ostre plastry mózgu za pomocą wibratomu i zagazowanego, lodowatego aCSF.

Zbierz wycinki obszaru zainteresowania i zminimalizuj ich ekspozycję na światło, aby uniknąć aktywacji sondy optogenetycznej. Pozwól plasterkom dojść do siebie przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w tym samym CSF. Użyj komory specjalnie zaprojektowanej do przechowywania plasterków mózgu. Następnie przywróć plastry do temperatury pokojowej, w której pozostaną zdrowe przez sześć do ośmiu godzin.

Aby kontynuować, przenieś plasterek do komory nagrywającej i połącz go z szybkością dwóch mililitrów na minutę aCSF. Następnie krótko sprawdź sygnał wyrażonego reportera fluorescencyjnego, aby upewnić się o lokalizacji i intensywności infekcji. Następnie napełnij elektrodę łatową roztworem wewnątrzkomórkowym.

Teraz, w świetle podczerwonym, uzyskaj szczelną konfigurację całej komórki na neuronie, który odbiera sygnały synaptyczne z zainfekowanych neuronów. Rezystancję szeregową można pozostawić bez kompensacji, ale powinna być stała i niska. Na przykład, jeśli neurony piramidowe CA3 zostały zainfekowane, załataj neurony piramidowe w proksymalnym i przyśrodkowym odcinku regionu CA1.

Kiedy komórki zaczynają wyglądać na skurczone lub spuchnięte, gdy łatanie staje się trudne lub łaty są niestabilne, oznacza to, że wybrane wycinki nie są wystarczająco długie, aby można było z nich nagrywać.

Następnie użyj farmakologii, aby wyizolować badane prądy synaptyczne. Na przykład, jeśli celem jest zbadanie pobudzającej transmisji synaptycznej, zablokuj hamującą transmisję synaptyczną poprzez dodanie bicukuliny do kąpieli.

Następnie wywołaj prądy synaptyczne, takie jak pobudzające prądy postsynaptyczne, za pomocą 473-nanometrowego niebieskiego lasera sprzężonego ze światłowodem umieszczonym na somatach zainfekowanych neuronów. Nie kieruj lasera na aksony neuronu.

Na przykład unikaj rzucania światła na zabezpieczenia Schaffera. Bezpośrednia depolaryzacja aksonów nie jest pożądana. Następnie dostosuj długość stymulacji do minimum, aby zmniejszyć możliwość wywołania więcej niż jednego potencjału czynnościowego na impuls świetlny.

Następnie dopracuj intensywność lasera, aby wywołać mały, ale wyraźnie wykrywalny prąd synaptyczny. Na przykład, w przypadku pobudzającej transmisji synaptycznej między neuronami piramidowymi CA3 i CA1, dostosuj intensywność lasera, aby wywołać prądy synaptyczne o natężeniu od 20 do 50 pikoamperów.