JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 3:34 min. • July 8th, 2025
Weź koronalny wycinek chemosensorycznego narządu lemieszowo-nosowego od transgenicznej myszy wykazującej ekspresję fluorescencyjnie znakowanych neuronów czuciowych.
Nabłonek czuciowy zawiera te znakowane neurony, które są wystawione na działanie światła połączonego z jamą nosową w celu wyczuwania sygnałów chemicznych.
Zabezpiecz plasterek w komorze obrazowania za pomocą kotwy do plastrów.
Przenieś komorę do zestawu rejestrującego i przepływnij natleniony roztwór zewnątrzkomórkowy, aby utrzymać żywotność tkanek.
Umieść pipetę perfuzyjną w pobliżu plastra, aby wprowadzić bodźce chemiczne, a pipetę rejestrującą na neurony czuciowe.
Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego zidentyfikuj znakowane neurony.
Zastosuj nadciśnienie, aby zapobiec zatkaniu pipety, i zbliż się do neuronu, aż na błonie utworzy się wgłębienie.
Przełącz na podciśnienie, wciągając membranę do pipety.
Zastosuj ssanie, aby rozerwać błonę i ustanowić ciągłość z cytoplazmą, zwaną klamrą łatową całej komórki, umożliwiając wprowadzenie bodźców chemicznych i zarejestrowanie powstałych sygnałów elektrofizjologicznych.
Przenieś plasterek VNO do komory obrazowania i ustal pozycję plastra za pomocą kotwy ze stali nierdzewnej okablowanej włóknami syntetycznymi o grubości 0,1 milimetra. Nie przykrywaj plastra chusteczki żadną z nici z włókien syntetycznych. Następnie przenieś komorę obrazowania do zestawu nagrywającego i w sposób ciągły przepełniaj plasterek natlenionym S2 w temperaturze pokojowej.
Dopasuj kapilę ssącą do powierzchni roztworu, aby zapewnić ciągłą wymianę roztworu kąpieli. Następnie wyreguluj wielolufowy ołówek perfuzyjny 8 w 1 powyżej i blisko niesensorycznej części wycinka VNO, który zawiera naczynie krwionośne. Następnie połącz elektrodę odniesienia i roztwór do kąpieli za pomocą mostka agarowego w kształcie litery L wypełnionego 150 milimolowym chlorkiem potasu.
Następnie napełnić pipetę z plastrem roztworem do pipet S4. Zamontuj pipetę na elektrodzie pokrytej chlorkiem srebra podłączonej do stopnia głowicy bez zeskrobywania powłoki i mocno zamocuj. Następnie należy lekko wycisnąć pipetę z plastrem przed wejściem do kąpieli. Monitoruj pipetę i upewnij się, że mieści się w zakresie od czterech megaomów do 10 megaomów.
Wizualizuj wycinek VNO za pomocą kamery CCD przy użyciu zoptymalizowanego pod kątem podczerwieni DIC i zidentyfikuj komórki eksprymujące FPR-rs3-i-Venus lub podobnie oznakowane neurony za pomocą oświetlenia fluorescencyjnego i odpowiedniej kostki filtrującej. Zbliż się do korpusu komórki za pomocą pokręteł, aby uzyskać maksymalną czułość. Ze względu na nadciśnienie widoczne jest niewielkie wgniecenie na błonie soma komórki, gdy końcówka pipety znajdzie się w bliskiej odległości.
Następnie zwolnij nadciśnienie i zastosuj lekkie podciśnienie, aby zassać błonę komórkową, aby uzyskać uszczelnienie o wysokiej rezystancji od 1 do 20 gigaomów. Następnie zastosuj krótkie i delikatne ssanie, aby przerwać błonę komórkową i ustalić konfigurację całej komórki.