Jednoczesny pomiar wewnątrzkomórkowego potencjału wapnia i błony w śródbłonku mózgu myszy

Weź odcinki tylnej tętnicy mózgowej myszy.

Inkubuj z roztworem enzymu, aby zdegradować macierz tkankową, rozluźniając komórki.

Zastąp roztwór buforem, a następnie przenieś segment do komory rejestrującej.

Mechanicznie dysocjuj warstwę tkanki łącznej i komórek mięśni gładkich, izolując leżącą poniżej rurkę śródbłonka.

Zabezpiecz rurkę, usuń zdysocjowane warstwy i dodaj bufor fizjologiczny.

Umieścić komorę w systemie rejestrującym z ciągłym przepływem buforowym.

Wprowadź fluorescencyjny wskaźnik wapnia, który dostaje się do komórek śródbłonka, a następnie włóż elektrodę rejestrującą do komórki.

Podaj lek, który wyzwala napływ jonów wapnia i indukuje dalszą sygnalizację uwalniania wapnia z retikulum endoplazmatycznego.

Wskaźnik wiąże się z wapniem i po wzbudzeniu emituje fluorescencję.

Wzrost stężenia wapnia aktywuje zależne od wapnia kanały potasowe, powodując odpływ potasu i zmieniając potencjał błonowy.

Jednoczesne rejestrowanie zmian wewnątrzkomórkowego wapnia za pomocą sygnału fluorescencyjnego i potencjału błonowego za pomocą elektrody.

W tej procedurze należy przygotować aparat do rozcierania za pomocą mikroskopu, kamery i aluminiowego stolika z komorą i mikromanipulatorami. Zabezpieczyć mikrostrzykawkę ze sterownikiem pompy przylegającym do stolika i próbki. Następnie całkowicie napełnij pipetę do rozcierania olejem mineralnym i zabezpiecz ją nad tłokiem mikrostrzykawki.

Następnie, za pomocą mikrostrzykawki ze sterownikiem pompy, należy pobrać do pipety około 130 nanolitrów roztworu dysocjacyjnego, upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Następnie umieść nienaruszone odcinki tętnic w jednym mililitrze roztworu dysocjacyjnego o wymaganych stężeniach enzymów w 10-mililitrowej szklanej probówce.

Inkubować w temperaturze 34 stopni Celsjusza przez 10 do 12 minut w celu częściowego trawienia. Po roztrawieniu zastąp roztwór enzymu 5 mililitrami świeżego roztworu dysocjacyjnego. Za pomocą pipety o pojemności 1 mililitra przenieś jeden segment do komory zawierającej roztwór dysocjacyjny w temperaturze pokojowej.

Następnie umieść pipetę w roztworze dysocjacyjnym w komorze i umieść ją blisko jednego końca strawionego naczynia. Ustaw szybkość w zakresie od 2 do 5 nanolitrów na sekundę na sterowniku pompy, aby uzyskać delikatne rozcieranie. Patrząc w powiększeniu od 100 do 200 razy, wycofaj i wysuń odcinek tętniczy, aby zdysocjować komórki mięśni gładkich, jednocześnie wytwarzając rurkę śródbłonka.

W razie potrzeby ostrożnie użyj kleszczyków z cienką końcówką, aby oddzielić zdysocjowaną przydankę i wewnętrzną elastyczną blaszkę od rurki śródbłonka. Upewnij się, że wszystkie komórki mięśni gładkich są zdysocjowane i że tylko komórki śródbłonka pozostają jako nienaruszona rurka.

Za pomocą mikromanipulatorów przymocuj każdy koniec rurki śródbłonka do szklanego szkiełka nakrywkowego komory superfuzyjnej za pomocą pipet do kołków ze szkła borokrzemianowego. Wypłukać zdysocjowane komórki przydanki i mięśni gładkich z komory i zastąpić roztwór dysocjacyjny dwoma milimolowymi komórkami chlorku wapnia PSS.

Przenieś mobilną platformę przymocowaną do rurki śródbłonka na mikroskop superfuzji i stanowisko eksperymentalne. Następnie użyj sześciu czystych 50-mililitrowych zbiorników do ciągłego dostarczania PSS i odpowiednich roztworów leków podczas eksperymentu.

Użyj wbudowanego zaworu sterującego przepływem, aby ręcznie ustawić natężenie przepływu tak stałe, jak przepływ laminarny, jednocześnie dopasowując przepływ zasilania do ssania próżniowego. Dostarczyć PSS do komory w celu przefuzji rurki śródbłonka przez co najmniej pięć minut przed zarejestrowaniem danych tła i załadowaniem barwnika.

Aby zmierzyć potencjał błonowy jednocześnie ze stężeniem wapnia w wewnątrzkomórkowych stanach, wyciągnij ostrą elektrodę i wypełnij ją dwoma molowymi chlorkami potasu, aby zarejestrować z komórek obciążonych barwnikiem Fura-2.

Aby zbadać sprzężenie międzykomórkowe poprzez transfer barwnika, należy wypełnić mikroelektrodę 0,1% jodkiem propidyny rozpuszczonym w dwumolowym chlorku potasu. Następnie umieść elektrodę na srebrnym drucie pokrytym chlorkiem w uchwycie pipety przymocowanym do stopnia głowicy elektrometru zabezpieczonego mikromanipulatorem.

Użyj mikromanipulatora, aby na krótko umieścić końcówkę elektrody w przepływającym PSS w komorze, patrząc przez czterokrotny obiektyw. Następnie ustaw spoczynkowy potencjał membrany na zero, zgodnie z potencjałem kąpieli z uziemieniem.

W razie potrzeby użyj dźwiękowych monitorów linii bazowej połączonych z elektrometrami, aby skojarzyć wysokość dźwięku z potencjalnymi nagraniami. Następnie zwiększ powiększenie do 400 razy za pomocą 40-krotnego obiektywu i umieść końcówkę elektrody tuż nad komórką rurki śródbłonka.

Dostosuj okno fotometryczne za pomocą oprogramowania fotometrycznego, aby ustawić ostrość na około 50 do 80 komórkach śródbłonka. Następnie delikatnie umieść elektrodę w jednej z komórek rurki śródbłonka za pomocą mikromanipulatora i odczekaj co najmniej dwie minuty, aż spoczynkowy potencjał błony ustabilizuje się.

Gdy spoczynkowy potencjał błonowy ustabilizuje się na oczekiwanej wartości, włącz rurkę fotopowielacza na granicy fluorescencji przy braku światła i rozpocznij pozyskiwanie wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia poprzez wzbudzanie Fura-2, naprzemiennie, na 340 i 380 nanometrach, zbierając emisję fluorescencji na 510 nanometrach.

Po ustaleniu jednoczesnych pomiarów potencjału błonowego i wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia, przed zastosowaniem leków należy odczekać około pięciu minut na superfuzję rurki śródbłonkowej z PSS przy stałym natężeniu przepływu laminarnego.

Lek przygotowany w PSS należy nanieść do komory przefuzyjnej ze stałym natężeniem przepływu. Podczas leczenia farmakologicznego należy jednocześnie mierzyć potencjał błonowy w stosunku F340/F380. Po zakończeniu eksperymentu wyjmij elektrodę z ogniwa. Następnie należy zatrzymać odpowiednie zapisy potencjału błonowego i wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia i zapisać pliki do analizy danych.