Stymulacja korzeni nerwów słuchowych i nagrania prądu postsynaptycznego w klinie mózgu myszy

Zabezpiecz wycinek mózgu transgenicznej myszy w komorze nagraniowej wypełnionej natlenionym aCSF.

Grubsza strona klina zawiera korzeń nerwu słuchowego i jądro ślimakowe, w tym T-gwiaździste i kuliste krzaczaste komórki.

Cieńsza strona zawiera przyśrodkowe i brzuszne jądro ciała trapezoidalnego z fluorescencyjnymi przyśrodkowymi neuronami oliwkowo-ślimakowymi.

Zlokalizuj pod mikroskopem korzeń nerwu słuchowego i umieść na nim elektrodę stymulującą.

Zidentyfikuj fluorescencyjny przyśrodkowy neuron oliwkowo-ślimakowy i przesuń w jego kierunku pipetę rejestrującą.

Załataj neuron, aby uzyskać konfigurację całej komórki i zarejestrować jego aktywność elektryczną.

Zastosuj impulsy elektryczne do korzenia nerwu słuchowego, aktywując komórki jądra ślimakowego.

Aktywowane komórki T-gwiaździste uwalniają pobudzające neuroprzekaźniki do przyśrodkowych neuronów oliwkowo-ślimakowych.

Jednak kuliste, krzaczaste komórki aktywują szlaki hamujące, uwalniając hamujące neuroprzekaźniki do przyśrodkowych neuronów oliwkowo-ślimakowych.

Integracja sygnałów pobudzających i hamujących powoduje powstawanie prądów postsynaptycznych, potwierdzających aktywność neuronalną w obrębie wycinka.

Aby ustawić plasterek klinowy do analizy elektrofizjologicznej, umieść próbkę w komorze rejestracyjnej, która jest stale perfuzjowana w temperaturze 35 stopni Celsjusza aCSF i ustabilizuj plasterek. Korzystając z optyki DIC, skup się na korzeniu nerwu słuchowego po grubej stronie plastra i użyj mikromanipulatora, aby przesunąć bipolarną elektrodę stymulującą wolfram do korzenia nerwu słuchowego i delikatnie wbić się w powierzchnię tkanki.

Przenieś pole widzenia na jądro brzuszne ciała trapezoidalnego po cienkiej stronie i wybierz przyśrodkowy neuron oliwkowo-ślimakowy jako cel elektrofizjologii patch-clamp pod epifluorescencją przy użyciu filtra emisyjnego 561 nm. Napełnij pipetę rejestracyjną odpowiednim roztworem wewnętrznym dla proponowanego eksperymentu, a następnie pod optyką DIC, nałać i zapisać z przyśrodkowego neuronu oliwkowo-ślimakowego w konfiguracji całej komórki.

Dostosuj amplitudę stymulacji elektrycznej korzenia nerwu słuchowego, aby uzyskać spójne zdarzenia postsynaptyczne w przyśrodkowym neuronie oliwkowo-ślimakowym. Następnie uruchom odpowiednie protokoły stymulacji, aby zaobserwować wywołane prądy synaptyczne w przyśrodkowych neuronach olivocochlear.