Wykrywanie reakcji fizjologicznych neuronów czuciowych u Drosophila

Przymocuj znieczulony, genetycznie zmodyfikowany Drosophila melanogaster na boku do szkiełka nakrywkowego.

Rozciągnij przednie kończyny i zabezpiecz je, aby odsłonić segmenty stępu.

Segmenty te mają neurony smakowe wyrażające kompleksy wskaźnikowe wapnia, które fluoryzują w postaci związanej z wapniem.

Narysuj hydrofobową barierę wokół muchy, aby zatrzymać roztwór.

Pozwól muszce dojść do siebie i nałóż buforowany roztwór soli fizjologicznej na odsłonięte segmenty stępu, aby je zwilżyć.

Pod mikroskopem konfokalnym obserwuj segmenty stępu i zobrazuj neurony smakowe na różnych głębokościach, aby uzyskać fluorescencję przed stymulacją.

Dodać do segmentu roztwór stymulacyjny zawierający lipofilowe ligandy.

Ligandy te wiążą się z receptorami neuronów smakowych, inicjując szlaki sygnałowe i wyzwalając otwieranie kanałów wapniowych.

Dzięki temu jony wapnia z płynu pozakomórkowego mogą dostać się do cytoplazmy i związać się z kompleksami wskaźnikowymi wapnia, powodując emisję fluorescencji.

Przy ponownej obserwacji wzrost fluorescencji neuronów potwierdza fizjologiczną odpowiedź neuronów na ligand.

Po znieczuleniu muchy przymocuj ją do 0,17-milimetrowego szkiełka nakrywkowego, używając bardzo małej kropli przezroczystego lakieru do paznokci. Przymocuj bok rozporka do zjeżdżalni, używając całego zrzutu. Następnie, pod mikroskopem preparacyjnym, użyj mokrego pędzla, aby przedłużyć przednią nogę muchy. Następnie, za pomocą dwóch bardzo cienkich pasków taśmy, przymocuj pierwszy i piąty segment stępu do szkiełka nakrywkowego.

Jeśli neurony w trąbce mają być zobrazowane, umieść kolejny cienki pasek taśmy na mównicy trąbki, aby odsłonić etykietę. Teraz zrób krótką ścianę wokół muchy za pomocą długopisu PAP. Pozwól, aby znieczulenie ustąpiło na pół godziny przed wykonaniem pomiarów. Do tego protokołu należy przygotować niezbędne rozcieńczenia podstawowego roztworu liganda o stężeniu 1 miligram na mililitr przy użyciu PBST.

Aby rozpocząć zabieg, należy nałożyć 10 mikrolitrów PBST na zabezpieczone i odsłonięte segmenty stępu. To nawilża nogę i zapobiega jej nieostrości. Następnie skoncentruj się na segmentach za pomocą układu optycznego, który może osiągnąć dobry sygnał fluorescencyjny z szybką rozdzielczością czasową, takiego jak mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem z kamerą sCMOS. Zbierz trzy stosy Z przed stymulacją interesujących neuronów w segmencie stępu.

W tym przykładzie obrazy są rejestrowane z ekspozycją 200 milisekund i kategoryzacją 2 na 2 w sekcji o wymiarach 6 na 1/2 mikrona co dwie sekundy. Pamiętaj, aby zoptymalizować moc lasera, aby zminimalizować fotowybielanie, jednocześnie umożliwiając wysoki stosunek sygnału do szumu. W tym przypadku laser o długości 491 nanometrów i mocy 100 miliwatów działa z transmisją 30%.

Sygnał musi być wykrywalny przed stymulacją, ale nie może zbliżać się do saturacji. Teraz należy pipetować 10 mikrolitrów roztworu stymulacyjnego na interesujący nas segment stępu. Podczas pipetowania należy zachować szczególną ostrożność, aby nie dotknąć nogi ani ciała muchy, w przeciwnym razie stęp przesunie się z pozycji. Następnie natychmiast uzyskaj pierwsze obrazy po stymulacji i kontynuuj zbieranie wystarczającej liczby obrazów, aby udokumentować maksymalną zmianę fluorescencji.