JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 2:43 min. • July 8th, 2025
Zacznij od larw Drosophila, z odsłoniętymi włóknami mięśniowymi i nerwowymi zanurzonymi w roztworze zawierającym pęcherzyki barwnika membranowego fluorescencyjnego lub barwnika FM.
Barwnik FM wiąże się z lipidami w błonie komórkowej, tworząc na niej powłokę fluorescencyjną
.Za pomocą mikromanipulatora umieść końcówkę mikroelektrody ssącej pod mikroskopem.
Skoncentruj się na włóknach nerwowych i mikroelektrodzie.
Użyj podciśnienia, aby zassać pętlę włókna nerwowego do mikroelektrody.
Zastosuj impulsy prądu, aby stymulować włókno nerwowe.
To wyzwala połączenie nerwowo-mięśniowe, w którym neuron ruchowy łączy się z włóknem mięśniowym, aby zainicjować endocytozę pęcherzyków synaptycznych.
Podczas tego procesu komórka pochłania błonę pokrytą barwnikiem FM, tworząc barwione pęcherzyki endocytarne, idealne do wizualizacji presynaptycznych etapów neuroprzekaźnictwa.
Zmyj barwnik FM i wymień roztwór zewnętrzny.
Zastosuj impulsy prądu, aby usunąć pęcherzyki zabarwione barwnikiem FM z komórki.
Do stymulacji elektrycznej przygotuj pipetę ssącą za pomocą ściągacza do mikroelektrod, aby uzyskać wymagany rozmiar stożka i końcówki. Następnie wypoleruj końcówkę mikroelektrody za pomocą mikrokuźni, aby uzyskać ścisłe dopasowanie podczas zasysania pojedynczego nerwu ruchowego.
Wsuń pipetę ssącą na uchwyt elektrody na mikromanipulatorze, który jest przymocowany do długiej, elastycznej rurki z tworzywa sztucznego i strzykawki. Następnie umieść preparat z barwnikiem FM na stoliku mikroskopowym i podnieś stopień, aż larwa i pipeta ssąca będą w ostrości.
Następnie zassać pętlę przeciętego nerwu ruchowego, unerwiając wybrany półsegment za pomocą podciśnienia powietrza wytwarzanego przez strzykawkę do elektrody ssącej. Następnie stymuluj nerw ruchowy za pomocą wybranych parametrów do napędzania endocytozy SV i wychwytu barwnika FM1-43.
Najważniejszym krokiem na tym etapie procedury jest zassanie pojedynczego aksonu silnika do elektrody ssącej z ciasnym dopasowaniem. Może to wymagać kilku prób i błędów. Po znalezieniu odpowiedniej elektrody ssącej należy użyć tej samej elektrody do wszystkich porównywanych warunków, aby zapewnić stałą siłę stymulacji.
Aby rozładować barwnik FM, zassaj ten sam nerw ruchowy do tej samej elektrody, a następnie stymuluj nerw ruchowy do aktywacji egzocytozy SV i uwalniania barwnika FM1-43.