JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 2:42 min • July 8th, 2025
Umieścić żywy preparat nerwowo-mięśniowy larw Drosophila w komorze rejestracyjnej zawierającej sól fizjologiczną bez wapnia.
Neurony larwalne wyrażają światłoczuły kanał kationowy.
Przełącz się na sól fizjologiczną z dodatkiem wapnia zawierającą barwnik fluorescencyjny.
Barwnik słabo fluoryzuje w stanie niezinternalizowanym, ale silnie, gdy jest internalizowany przez neurony.
Oświetl larwę niebieskim światłem.
To aktywuje kanał, indukując napływ kationów i depolaryzację neuronów, inicjując potencjał czynnościowy.
Potencjał czynnościowy dociera do zakończenia synaptycznego w połączeniu nerwowo-mięśniowym, umożliwiając napływ wapnia i egzocytozę pęcherzyków.
Następnie membrana związana z barwnikiem jest internalizowana podczas recyklingu pęcherzyków.
Przemyć solą fizjologiczną bez wapnia, aby zatrzymać recykling pęcherzyków i usunąć wszelkie niezinternalizowane barwniki.
Wizualizacja sygnału fluorescencji.
Następnie wprowadź bezbarwną sól fizjologiczną z dodatkiem wapnia i ponownie rozświetl.
To indukuje inny potencjał czynnościowy, napływ wapnia i egzocytozę pęcherzyków zawierających barwnik.
Ponownie zwizualizuj sygnał.
Uwalnianie barwnika w wyniku egzocytozy pęcherzyków zmniejsza fluorescencję w porównaniu ze stanem podczas internalizacji pęcherzyków.
W celu stymulacji rodopsyny kanałowej podłącz niebieską diodę LED do programowalnego stymulatora za pomocą koncentrycznego i umieść diodę LED w porcie kamery. Skoncentruj niebieską wiązkę światła LED na preparacie z barwnikiem FM za pomocą funkcji zoomu mikroskopu.
Najważniejszym krokiem na tym etapie procedury jest upewnienie się, że ustawienia diod LED są utrzymywane na stałym poziomie i że oświetlasz tę samą część każdego zwierzęcia we wszystkich porównywanych warunkach, aby zapewnić stałą siłę stymulacji.
Rozpocznij stymulację światłem i śledź za pomocą timera przez określony czas trwania okresu stymulacji optogenetycznej. Gdy timer się zatrzyma, szybko usuń roztwór barwnika FM i zastąp go solą fizjologiczną bez wapnia, aby zatrzymać cykl SV. W celu rozładunku barwnika FM rozpocznij stymulację światłem i śledź za pomocą timera przez określony czas trwania okresu stymulacji optogenetycznej. Po upływie okresu odliczania szybko usuń roztwór barwnika FM i zastąp go solą fizjologiczną bez wapnia, aby zatrzymać cykl SV.