Ocena synaps wstęgowych w określonych obszarach częstotliwości ślimaka myszy

Zacznij od probówek zawierających wstępnie potraktowane skręty ślimaka myszy ze środkiem przepuszczalnym i środkiem blokującym, które zapobiegają niespecyficznym interakcjom.

Każdy obrót wykrywa różne częstotliwości dźwięku i zawiera komórki rzęsate, które przekształcają dźwięk w sygnały elektryczne. Sygnały te są przekazywane przez neuroprzekaźniki w synapsach wstęgowych do nerwu słuchowego.

Usuń roztwór i dodaj pierwszorzędowe przeciwciała, które oddziałują z białkami w komórkach włosa i nerwowych w synapsach wstęgowych, a następnie umyj.

Inkubuj z przeciwciałami drugorzędowymi oznaczonymi czerwonymi i zielonymi fluoroforami, które wiążą się ze swoimi pierwszorzędowymi przeciwciałami.

Przemyć w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał drugorzędowych.

Umieścić próbkę na szkiełku podstawowym z podłożem montażowym zawierającym barwnik jądrowy w celu zabarwienia jąder na niebiesko.

Zamontuj szkiełko nakrywkowe. Wysusz go, a następnie użyj mikroskopu konfokalnego, aby zobrazować każdy segment na różnych głębokościach.

Synapsy wstęgowe pojawiają się jako blisko siebie umieszczone czerwone i zielone puncta.

Policz te funkcjonalne punkty w każdej turze, aby skorelować ich reakcję na częstotliwość dźwięku.

Po rozbiorze umieść każdy obrót ślimaka w osobnych 2,5-mililitrowych probówkach wirówkowych. Zablokuj wszelkie niespecyficzne wiązania z 10% kozią surowicą w PBS w 0,1% Triton X-100 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na rotatorze.

Pod koniec inkubacji użyj końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby usunąć roztwór pod mikroskopem preparacyjnym. Inkubować próbki z podstawowymi przeciwciałami będącymi przedmiotem zainteresowania rozcieńczonymi w 5% surowicy koziej w PBS i 0,1% Triton X-100 przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza na rotatorze.

Następnego ranka przepłucz próbki tkanek trzy razy przez 5 minut zimnym 0,1 molowym PBS na płukanie, aby usunąć resztki przeciwciał pierwszorzędowych. Następnie oznacz próbki odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi rozcieńczonymi w 5% surowicy koziej w PBS i 0,1% Triton X-100 przez dwie do trzech godzin w temperaturze pokojowej na rotatorze, chroniąc przed światłem.

Pod koniec inkubacji przemyć próbki trzykrotnie 0,1-molowym PBS, jak pokazano, i przenieść próbki na indywidualne 35-milimetrowe płytki zawierające 0,1-molowego PBS. Umieścić kroplę podłoża montażowego uzupełnionego DAPI na szkiełku podstawowym i przenieść próbki z PBS na podłoże montażowe. Umieść jedną krawędź szkiełka nakrywkowego na każdym szkiełku podstawowym i zwolnij, aby szkiełka nakrywkowe delikatnie opadły. Następnie wysusz szkiełka w pudełku na szkiełka w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc.

Aby zobrazować próbki, użyj mikroskopu konfokalnego z odpowiednimi laserami i 63-krotną soczewką immersyjną o wysokiej rozdzielczości. Uzyskanie 8-mikrometrowych konfokalnych stosów Z z każdego obrotu ślimaka. W przypadku zliczania punktów synaptycznych ustaw stosy z krokiem 0,3 mikrometra tak, aby obejmowały całą długość wewnętrznych komórek rzęsatych, upewniając się, że wszystkie punkty synaptyczne mogą być obrazowane, i połącz obrazy zawierające puncta w stos, aby uzyskać projekcję osi z.

Zaimportuj scalone obrazy do odpowiedniego oprogramowania do przetwarzania obrazów. Podziel całkowitą liczbę synaps w każdym stosie z w określonych regionach częstotliwości przez liczbę wewnętrznych komórek rzęsatych DAPI-dodatnich, aby obliczyć liczbę punktów synaptycznych dla każdej komórki. W każdym określonym obszarze częstości uśrednij wszystkie punkty synaptyczne na 3 obrazach różnych mikroskopijnych pól zawierających od 9 do 11 wewnętrznych komórek rzęsatych.

Aby lepiej zobrazować architekturę cytoszkieletu i lokalizację synaptyczną, użyj narzędzia pędzelka, aby wizualnie ocenić strukturę synaptyczną i rozmieszczenie poszczególnych wewnętrznych komórek rzęsatych. Aby sprawdzić zestawienie wstążek presynaptycznych i plam receptorów postsynaptycznych, użyj narzędzia do zaznaczania prostokątnego, aby wyodrębnić przestrzeń woksela wokół wstążek i użyj cięcia obrazu, aby wyizolować poszczególne wstążki. Następnie kliknij opcję Obraz i Rozmiar obrazu, aby uzyskać tablicę miniatur tych miniaturowych projekcji, których można użyć do zidentyfikowania sparowanych synaps i sierocych wstążek.