Barwienie immunologiczne fluorescencji neuronów hipokampa szczura w chipie mikroprzepływowym

Weźmy chip mikroprzepływowy zawierający neurony hipokampa szczura.

Chip zawiera zbiorniki somatyczne i aksonalne, z przedziałami podzielonymi mikrorowkami, skutecznie dzieląc neurony i izolując regiony somatyczne i aksonalne.

Usuń podłoże i dodaj formaldehyd. Inkubuj, aby naprawić neurony i zachować ich strukturę.

Usuń nadmiar formaldehydu i przemyj buforem. Następnie dodaj detergent, aby przepuszczalność neuronów.

Zastąp detergent roztworem blokującym, aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania.

Usuń roztwór blokujący i inkubuj z pierwszorzędowymi przeciwciałami, które wiążą się ze specyficznymi neuronalnymi markerami synaptycznymi, które są integralnymi białkami błonowymi na pęcherzykach synaptycznych.

Usunąć niezwiązane przeciwciała i przemyć buforem.

Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi znakowanymi fluoroforem, które wiążą się z przeciwciałami pierwszorzędowymi skierowanymi przeciwko markerom synaptycznym.

Usunąć niezwiązane przeciwciała drugorzędowe i przemyć buforem.

Pod mikroskopem konfokalnym zobrazuj chip, aby uwidocznić fluorescencyjne markery synaptyczne neuronów.

Aby rozpocząć barwienie immunologiczne fluorescencyjne, usuń większość pożywki z chipa, utrzymując nawilżenie wewnętrznych komór. Natychmiast dodaj 100 mikrolitrów roztworu utrwalającego do górnych studzienek przedziałów aksonalnych i somatycznych.

Po jednej minucie dodaj 100 mikrolitrów roztworu utrwalającego do studzienek dennych i utrwalaj komórki przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Usuń większość roztworu ze studzienek i natychmiast dodaj 150 mikrolitrów PBS do każdej z górnych studzienek przedziałów aksonalnych i somatycznych. Odczekaj dwie minuty, aż PBS spłynie do studzienek dennych, a następnie wyjmij PBS i przepłucz studzienki jeszcze dwukrotnie, stosując ten sam proces.

Po ostatnim płukaniu usuń większość PBS z dołków chipa i natychmiast dodaj 150 mikrolitrów PBS z 0,25% Triton X-100 do każdej z górnych studzienek przedziałów aksonalnych i somatycznych.

Odczekaj 15 minut, a następnie usuń większość płynu z dołków. Natychmiast dodaj 150 mikrolitrów roztworu blokującego do każdej z górnych studzienek przedziałów aksonalnych i somatycznych. Po 15 minutach usuń większość płynu z dołków i natychmiast dodaj 100 mikrolitrów roztworu przeciwciała pierwotnego do każdej z górnych studzienek przedziałów aksonalnych i somatycznych.

Przykryj chip, aby zminimalizować parowanie, i inkubuj komórki w pierwotnym przeciwciałie przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie przepłucz chip, usuwając większość roztworu i natychmiast dodając 150 mikrolitrów PBS do każdej z górnych studzienek przedziałów aksonalnych i somatycznych. Po pięciu minutach wyjmij PBS z obu studzienek i powtórz płukanie jeszcze dwa razy.

Teraz usuń większość płynu z dołków i natychmiast dodaj 100 mikrolitrów przeciwciała wtórnego w PBS do każdej z górnych studzienek przedziałów aksonalnych i somatycznych. Przykryj chip, aby zminimalizować parowanie, i inkubuj chip przez godzinę w temperaturze pokojowej. Jak pokazano wcześniej, spłucz chip trzy razy za pomocą PBS. Następnie zamontuj i zobrazuj chipy zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym.