JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Neuronauka
0 wyświetleń • 1:59 min. • July 8th, 2025
Weźmy hodowlę pierwotnych neuronów ziarnistych móżdżku u myszy.
Dodać pożywkę zawierającą nadtlenek wodoru, reaktywną formę tlenu lub RFT i krótko inkubować.
Nadtlenek wodoru dyfunduje do komórek i jest przekształcany w wysoce reaktywne wolne rodniki.
Rodniki te indukują peroksydację lipidów, naruszając integralność błony komórkowej.
Dodatkowo rodniki powodują modyfikacje oksydacyjne białek komórkowych, upośledzając ich funkcję.
Ponadto wywołują pęknięcia DNA, co prowadzi do niestabilności genomu.
Rodniki powodują również uszkodzenia oksydacyjne organelli wewnątrzkomórkowych, w tym mitochondriów.
W odpowiedzi uszkodzone mitochondria uwalniają cytochrom c, który wiąże się z czynnikiem aktywującym proteazę apoptotyczną-1, wywołując tworzenie apoptosomu i konwersję pro-kaspazy-9 do aktywnej kaspazy-9.
Kaspaza 9 aktywuje kaspazy katowskie, dalej rozszczepiając białka komórkowe i prowadząc do apoptotycznej śmierci neuronów.
Zastąp pożywkę świeżą pożywką wolną od nadtlenku wodoru, aby zatrzymać kaskadę sygnalizacyjną.
W przypadku śmierci komórki wywołanej przez ROM należy traktować neurony nadtlenkiem wodoru o stężeniu od 75 do 100 mikromolów przez pięć minut. Po pięciu minutach przełącz go na kondycjonowane podłoża z równoległych kultur.
Ze względu na niestabilność nadtlenku wodoru stężenie musi być zoptymalizowane do poziomu, który indukuje od 50% do 70% śmierci komórki po 24 godzinach. Stężenie to wynosi zwykle od 75 do 100 mikromolów.