Mechaniczne uszkadzanie nerwów segmentowych larw Drosophila w celu wywołania neurodegeneracji

Weź larwy Drosophila w trzecim stadium rozwoju i znieczul je dwutlenkiem węgla.

Pod mikroskopem ustaw larwy z brzuszną powierzchnią skierowaną do góry, aby uwidocznić nerwy segmentowe.

Nerwy te zawierają neurony ruchowe, które unerwiają mięśnie ściany ciała i kontrolują ruch larw.

Zakończenia aksonów tych neuronów łączą się z włóknami mięśniowymi, tworząc połączenia nerwowo-mięśniowe lub NMJ.

Neurony uwalniają neuroprzekaźniki, które wiążą się z receptorami na włóknach mięśniowych, powodując napływ jonów i wyzwalając transmisję sygnału.

Za pomocą kleszczy uszczypnij naskórek brzuszny, aby uszkodzić nerwy segmentowe, hamując w ten sposób ruch.

Umieść zranione larwy na talerzu agarowym z pokarmem dla larw, aby zapewnić przeżycie.

Umieść talerz w naczyniu, przykryj go wilgotnym ręcznikiem papierowym, aby utrzymać wilgoć, i przechowuj go w pojemniku, aby umożliwić powrót larw do zdrowia.

Z czasem uraz prowadzi do śmierci neuronu ruchowego, znanej jako neurodegeneracja, która zaburza pracę NMJ.

Umieść każdą larwę na aparacie znieczulającym CO₂ . Pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie przetocz każdą larwę na jej grzbietową stronę, aby uwidocznić nerwy segmentowe w całym naskórku.

Konieczne jest ostrożne przetoczenie każdej larwy na stronę grzbietową, aby uwidocznić nerwy segmentowe przez naskórek przed urazem.

Zaczynając od haczyków gębowych, umieść kleszcze w rozmiarze 5 około połowy do 2/3 długości larw. Po ustawieniu uszczypnij około jednej trzeciej naskórka brzusznego zawierającego nerwy segmentowe za pomocą kleszczy o rozmiarze 5. Aby upewnić się, że nerwy segmentowe larw są uszkodzone, należy zastosować wystarczającą siłę, aby zmiażdżyć nerwy segmentowe, ale pozostawić naskórek nienaruszony. Aby określić prawidłową siłę działania, zmiażdż 10 larw i upewnij się, że śmiertelność po pięciu godzinach wynosi poniżej 50%.

Po zranieniu ostrożnie przenieś larwy na talerz agarowy z sokiem owocowym zawierający około 0,5 grama pasty drożdżowej. Umieść każdą larwę tak, aby jej przedni koniec znajdował się na paście drożdżowej, aby kontynuować karmienie. Umieść płytki agarowe zawierające pastę drożdżową i 10 zranionych larw na dnie pustej szalki Petriego o wymiarach 100 na 15 milimetrów. Przykryj szalkę Petriego wilgotnym ręcznikiem papierowym, upewniając się, że ręcznik papierowy nie dotyka larw ani płytek agarowych. Następnie umieść szalkę Petriego w hermetycznym pojemniku o temperaturze pokojowej. Na koniec pobierz larwy do sekcji po określonych okresach po urazie.