Badanie uszkodzenia mózgu u larw danio pręgowanego za pomocą wielkoskalowej skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Weź osadzone w żywicy, chemicznie utrwalone ultracienkie sekcje mózgu od zdrowych i uszkodzonych w mózgu larw danio pręgowanego zamontowanych na siatce z jednym otworem.

Wycinki są barwione metalami ciężkimi w celu zwiększenia kontrastu obrazu podczas obrazowania mikroskopowego.

Umieścić siatkę w uchwycie na próbkę i przenieść ją do komory mikroskopowej.

Wyrównaj siatkę pod działem elektronowym, które generuje wiązkę elektronów.

Układ soczewek i cewek elektromagnetycznych skupia wiązkę elektronów na sekcjach.

Przesuń uchwyt próbki, aby zeskanować sekcje we wzorze rastrowym.

Gdy wiązka elektronów przechodzi przez skrawki tkanki, barwione obszary o dużej gęstości elektronów rozpraszają więcej elektronów, podczas gdy niebarwione obszary przenoszą elektrony.

Detektor zbiera te sygnały elektronowe, tworząc obrazy mózgu o wysokiej rozdzielczości.

W porównaniu z grupą kontrolną, uszkodzony mózg wykazuje mikroglej fagocytarny zawierający liczne inkluzje wewnątrzkomórkowe, co jest charakterystyczną cechą neurodegeneracji wywołanej urazem.

Aby zamontować próbkę w skaningowym mikroskopie elektronowym lub SEM, umieść siatkę ze skrzynki rozdzielczej z sekcją w uchwycie na próbkę z wieloma siatkami i przenieś ją do komory SEM. Po ustawieniu detektora zgodnie z protokołem tekstowym, należy wstępnie napromienić próbkę, pomniejszając tak, aby cały obszar do skanowania zmieścił się w oknie obrazu. Po zmianie przysłony na 120 mikrometrów i rozmyciu obrazu użyj opcji skanowania zredukowanego obszaru, aby zeskanowany obszar był jak najmniejszy.

Następnie ustaw liczbę klatek na sekundę, aby zeskanować klatkę w około 1 do 2 sekund. Następnie powiększ co najmniej 100x i skanuj mały obszar przez dziesięć sekund. Jeśli jasność w obszarze nadal się zmienia, kontynuuj naświetlanie przed naświetlaniem. Gdy obszar ten nie zmienia jasności w porównaniu z otoczeniem, wystarczające jest wstępne naświetlanie.

W obszarze ostrości wybierz najjaśniejszy obszar lub obiekt, a następnie ustaw szybkość skanowania tak, aby szczegóły były widoczne. W oprogramowaniu mikroskopu dostosuj jasność i kontrast, uważnie obserwując histogram, aby wszystkie piksele pozostały w zakresie dynamicznym. Zrób to samo dla najciemniejszych obszarów i obiektów. Wróć do jasnego obszaru i sprawdź ponownie, czy po obu stronach histogramu jest trochę miejsca.

W przypadku kroków od 4-6 do 4-8 regulacja jasności i kontrastu musi być wykonana bardzo ostrożnie, aby cały obszar mieścił się w zakresie dynamicznym.

Pomniejsz obraz, aby cały obszar do skanowania zmieścił się w oknie obrazowania i uruchom program akwizycji dużego obszaru. Następnie użyj opcji Kreatora, aby skonfigurować mozaikę, wybierając obszar z ekranu.

Użyj rozmiaru piksela od 2 do 5 nanometrów w zależności od tego, jakie szczegóły są niezbędne, i ustaw czas przebywania wynoszący trzy mikrosekundy dla skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej lub STEM. Naciśnij Optymalizuj, aby sprawdzić ustawienia mikroskopu, a zostanie wyświetlony wymagany czas. Następnie ponownie włącz zewnętrzny generator skanowania i naciśnij Kontynuuj.