Name: Profilowanie ekspresji mRNA kanału potasowego bramkowanego napięciem w neuronach nigralnych przy użyciu technik RT-PCR dla pojedynczych komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Poznaj metodę detekcji mRNA w pojedynczych neuronach przy użyciu patch clampingu i RT-PCR. Technika ta umożliwia analizę ekspresji genów dla kanałów jonowych i receptorów w badaniach neurofizjologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była wspierana przez granty NIH R01DA021194 oraz R01NS058850.

1. Przygotowanie skrawków mózgu
<ol>
	<li>Stosuje się młode (w wieku 15-40 dni) samce i samice szczurów Sprague-Dawley. (Ten sam protokół stosujemy również u myszy). Po wprowadzeniu w głęboką narkozę uretanową zwierzęta zostają poddane dekapitacji, a mózg jest szybko wycinany. Następnie na wibratomie Leica (VT-1200S) wykonuje się koronalne skrawki mózgu o grubości 300 μm zawierające środkową część rostralną istoty czarnej. Procedura cięcia skrawków odbywa się w lodowatym, napowietrzonym roztworze do cięcia o wysokim stężeniu sacharozy zawierającym (w mM): 220 sacharozy, 2.5 KCl, 1.25 NaH2PO4, 25 NaHCO3, 0.5 CaCl2, 7 MgCl2, 10 D-glukozy. Roztwór jest napowietrzany mieszaniną 95% O2/5% CO2 w celu utrzymania natlenienia oraz pH na poziomie 7.4. Przez całą procedurę należy utrzymywać roztwór do cięcia w temperaturze lodowej.</li>
	<li>Skrawki mózgu inkubuje się w komorze inkubacyjnej wypełnionej napowietrzonym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (aCSF) zawierającym (w mM): 125 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 NaH2PO4, 25 NaHCO3, 2.5 CaCl2, 1.3 MgCl2, 10 D-glukozy. Płyn jest napowietrzany mieszaniną 95% O2/5% CO2 w celu utrzymania natlenienia oraz pH na poziomie 7.4. Temperatura inkubacji wynosi 34 °C przez 45 min, a następnie temperatura pokojowa aż do momentu przeniesienia skrawka mózgu do komory rejestracyjnej.</li>
</ol>
2. Elektrofizjologiczna charakterystyka neuronów istoty czarnej
<ol>
	<li>Przekrój mózgu przenosi się do komory do rejestracji patch-clamp, w której stale perfundowany jest natleniony aCSF w temperaturze 32 °C.</li>
	<li>Pipety do patch-clampu są wyciągane z autoklawowanych szklanych kapilar borokrzemianowych (KG-33) (1.10 mm i.d., 1.65 mm o.d., King Precision Glass, Claremont, CA) przy użyciu wyciągarki PC-10 (Narishige, Tokyo, Japan) i napełniane roztworem wewnątrzkomórkowym przygotowanym w wodzie wolnej od DNazy i RNazy (Fisher Scientific) (zawierającym 135 mM KCl, 0.5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1.5 mM MgCl2, pH dostrojone do 7.3). Pipety do patch-clampu mają oporność 2-3 MΩ w kąpieli.</li>
	<li>Istotę czarną identyfikuje się na podstawie jej charakterystycznej lokalizacji anatomicznej (Rys. 1A1-2). Pod kontrolą wizualną mikroskopu wideo (Olympus BX51W1) wyposażonego w optykę Nomarskiego i obiektyw imersyjny 60X, do rejestracji wybiera się duże komórki w części zwartej istoty czarnej (SNc) oraz części siateczkowatej istoty czarnej (SNr) (prawdopodobne neurony DA i neurony GABA). Uzyskuje się konwencjonalną konfigurację whole-cell z gigaomowym uszczelnieniem (Rys. 1B1). Można przeprowadzić analizy w trybie current clamp oraz voltage clamp. Aby zminimalizować degradację mRNA, rejestracja elektrofizjologiczna powinna być krótka (≤5 min). Jedną z opcji jest rejestracja wyłącznie właściwości błonowych i impulsowania, aby uzyskać elektrofizjologiczne sygnatury interesujących neuronów (Rys. B2-3). Taka krótka rejestracja trwa tylko około 1 min.</li>
</ol>
3. Aspiracja cytoplazmy
<ol>
	<li>Po elektrofizjologicznym profilowaniu i charakterystyce neuronów GABA-ergicznych i dopaminergicznych (DA) w obrębie SNr, delikatnie zasysa się cytoplazmę. Może dojść również do zasysania jądra komórkowego, co prowadzi do kontaminacji genomowym DNA. Należy unikać przerwania szczelnego uszczelnienia (tight seal); w przeciwnym razie do pipety patchowej mogą zostać zassane zanieczyszczenia z przestrzeni pozakomórkowej, w tym mRNA, co zanieczyści zawartość komórki. Szczelność uszczelnienia uznaje się za dobrą, jeśli wzrost prądu podtrzymującego przy -70 mV nie przekracza 100 pA.</li>
	<li>Następnie zassana zawartość komórki jest wydmuchiwana do probówki PCR o pojemności 0,2 mL poprzez odłamanie końcówki pipety i zastosowanie niewielkiego nadciśnienia. Zawartość jednej komórki jest zbierana do jednej probówki PCR. Po pobraniu zawartości komórki, probówkę PCR, uprzednio schłodzoną w lodzie, natychmiast umieszcza się w zamrażarce w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Aby wykluczyć kontaminację zanieczyszczeniami pozakomórkowymi, które mogą zawierać mRNA, pipetę patchową opuszcza się do tkanki bez faktycznego zasysania cytoplazmy, a następnie zawartość pipety poddaje się analizie RT-PCR.</li>
</ol>
4. Odpis odwrotny (RT)
<ol>
	<li>Po zebraniu zawartości komórkowej z odpowiedniej liczby neuronów, zazwyczaj 10-20, należy niezwłocznie rozpocząć reakcję RT, aby zminimalizować degradację mRNA.</li>
	<li>Ze względu na to, że ilość zawartości komórkowej z pojedynczego neuronu jest zbyt mała, nie przeprowadza się procedury izolacji RNA. Aby usunąć potencjalne zanieczyszczenia w postaci DNA genomowego, aspirowaną zawartość komórkową najpierw trawiono DNazą I (5 μL DNase I i 1,6 μL DNase I Buffer, 5 min w 25 °C). Następnie DNazę I inaktywowano poprzez dodanie 1,2 μL 25 mM EDTA i inkubację w 75 °C przez 5 min.</li>
	<li>cDNA syntetyzowano przy użyciu zestawu Cells-Direct cDNA Synthesis opartego na odwrotnej transkryptazie SuperScript III (Invitrogen, Tabela 1). Pierwsza nić cDNA była syntetyzowana w 50 °C przez 50 min, następnie reakcję inaktywowano poprzez inkubację w 85 °C przez 5 min i dodano 1 μL RNazy H w celu trawienia mRNA (37 °C przez 20 min). Jednoniciowe cDNA przechowywano w -20 °C do późniejszej amplifikacji PCR.</li>
	<li>Całkowite usunięcie DNA genomowego weryfikowano za pomocą kontroli RT-minus, w której pominięto odwrotną transkryptazę, podczas gdy wszystkie pozostałe składniki reakcji były identyczne.</li>
</ol>
5. Dwuetapowa amplifikacja PCR
<ol>
	<li>Startery zaprojektowano na podstawie sekwencji w bazie GenBank. W miarę możliwości stosowano pary starterów obejmujące introny, co ułatwia wykrycie kontaminacji DNA genomicznym. Sekwencje par starterów wymieniono w Tabela 2Skuteczność par starterów należy najpierw zweryfikować za pomocą mRNA z całego mózgu, które dają pozytywne produkty. Wszystkie startery zostały zsyntetyzowane przez Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa, USA).</li>
	<li>W pierwszym etapie, 5 μL z 30 μL cDNA poddawane jest amplifikacji przez 35 cykli w obecności pary starterów (Tabela 2). Protokół cykli termicznych termocyklera (MasterCycler, Eppendorf, Tabela 1) wynosi 2 min w temperaturze 94 °C do początkowej denaturacji, następnie 35 cykli po 15 s w temperaturze 94 °C w celu denaturacji, 30 s w temperaturze 55°C do przyłączania (annealingu), oraz 45 s w temperaturze 72°C do przedłużenia, a następnie przez 7 min w celu końcowej elongacji. Taq polimeraza DNA, trifosforany deoksynukleotydów (dNTPs) oraz wszystkie pozostałe komponenty niezbędne do amplifikacji PCR są dostarczane w formie gotowej mieszaniny PCR (super mix) (Invitrogen, Tabela 1)</li>
	<li>W drugim etapie PCR produkt z 1 μL z 1Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. produkt amplifikacji PCR z pierwszego etapu służy jako matryca i stosuje się tę samą parę starterów, która była użyta w pierwszym etapie (Tabela 2). Przeprowadza się 40 cykli, skracając czas elongacji do 30 s. Stosuje się ten sam supermix do PCR.</li>
	<li>produkty PCR z 2nd produkty amplifikacji rozdziela się za pomocą elektroforezy w 2,5% żelu agarozowym, wizualizuje przy użyciu bromku etydyny (0,05 mg/100 ml żelu) lub GelGreen w świetle UV, a następnie fotografuje (Ryc. B4). Następnie wycina się pasma dodatnie i poddaje je ekstrakcji przy użyciu zestawu ekstrakcyjnego Qiagen (Tabela 1) i poddano sekwencjonowaniu, a następnie porównano z opublikowanymi sekwencjami genów docelowych.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki:
Neurony dopaminergiczne (DA) w istocie czarnej części zwartej (substantia nigra pars compacta) i części siateczkowatej (pars reticulata) oraz sąsiadujące neurony projekcyjne GABA-ergiczne w istocie czarnej części siateczkowatej wykazują odmienne charakterystyki elektrofizjologiczne (Zhou et al. 2006; Ding et al. 2011). Jak pokazano na Rys. 1B2, neurony GABA w SNr wykazują spontaniczną aktywność impulsową o wysokiej częstotliwości, wynoszącej około 10 Hz. Impulsy te mają czas trwania bazy około 1 ms. Po wstrzyknięciu prądu hiperpolaryzującego, neurony GABA w SNr wykazują słaby ugięcie (sag) depolaryzacyjne w odpowiedzi na wstrzyknięcie prądu hiperpolaryzującego, co wskazuje na słabą ekspresję prądu Ih w tych neuronach (Rys. 1B2). W przeciwieństwie do nich, neurony DA istoty czarnej wykazują spontaniczne impulsy o niskiej częstotliwości (około 2 Hz), których czas trwania bazy wynosi około 3 ms. Neurony DA wykazują również wyraźne ugięcie (sag) w odpowiedzi na wstrzyknięcie prądu hiperpolaryzującego, co świadczy o silnej ekspresji prądu Ih (Rys. 1B3) (Zhou et al. 2006; Ding et al. 2011).
Metodą scRT-PCR wykryto mRNA dladekarboksylazy kwasu glutaminowego 1 (GAD1, kluczowy enzym syntezy GABA i marker neuronów GABAergicznych) w elektrofizycznie zidentyfikowanych neuronach GABAergicznych SNr, ale nie w neuronach DA (Ryc. 1B4,5). Z kolei scRT-PCR wykazała obecność mRNA dla hydroksylazy tyrozynowej (TH, kluczowy enzym syntezy dopaminy i marker neuronów DA) w elektrofizycznie zidentyfikowanych neuronach DA w SNc i SNr, ale nie w neuronach GABAergicznych (Ryc. 1B4,5). Wyniki scRT-PCR potwierdzają zatem elektrofizyczną identyfikację neuronów. Następnie scRT-PCR wykorzystano do profilowania ekspresji podjednostek bramkowanych napięciowo kanałów Kv3: Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 oraz Kv3.4. Podjednostki te współtworzą napięciowo zależne kanały K+ o zróżnicowanych właściwościach, zależnych od składu podjednostek (Ding et al. 2011). W przykładzie neuronu GABAergicznego SNr przedstawionym na Ryc. 1B4 wykryto mRNA dla Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 i Kv3.4. W przykładzie neuronu DA w SNr przedstawionym na Ryc. 1B5 wykryto jedynie Kv3.2, Kv3.3 i Kv3.4. W naszych zbiorczych danych Kv3.1 wykryto częściej w neuronach GABAergicznych SNr niż w nigralnych neuronach DA, co wskazuje na wyższy poziom ekspresji Kv3.1 w szybko wyładowujących neuronach GABAergicznych SNr (Ding et al. 2011).
<img alt="Lokalizacja istoty czarnej w przekrojach barwionych metodą Nissla; wykresy analizy elektrofizjologicznej i molekularnej." src="/files/ftp_upload/3136/3136fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Elektrofizjologiczna identyfikacja neuronów GABA w SNr i neuronów DA w istocie czarnej. A: obszary istoty czarnej można zidentyfikować na podstawie ich wyraźnej lokalizacji anatomicznej. A1 przedstawia lokalizację SNc i SNr w koronalnym przekroju barwionym metodą Nissla, wykonanym przy użyciu obiektywu 1X. Obszar w ramce został uchwycony obiektywem 10X i wyświetlony w środku, zgodnie ze wskazaniem strzałki. Wyraźnie widoczne są bogata w komórki SNc oraz uboga w komórki SNr. A2 przedstawia lokalizację SNc i SNr w żywym, niebarwionym przekroju koronalnym, wykonanym przy użyciu obiektywu 4X. Bogata w komórki SNc i uboga w komórki SNr są również wyraźnie identyfikowalne. VTA, pole brzuszne nakrywki. B1 przedstawia neuron GABA w SNr poddany rejestracji patch-clamp w trybie whole-cell. B2 przedstawia typowe właściwości elektrofizjologiczne neuronów GABA w SNr w trybie rejestracji current-clamp. Neurony te generują spontaniczne, wysokoczęstotliwościowe potencjały czynnościowe o krótkim czasie trwania i wykazują słabą odpowiedź typu sag zależną od prądu Ih po wstrzyknięciu prądu hiperpolaryzującego. B3 przedstawia typowe właściwości elektrofizjologiczne neuronów DA w istocie czarnej w trybie rejestracji current-clamp. Generują one spontaniczne, niskoczęstotliwościowe potencjały czynnościowe o długim czasie trwania i wykazują wyraźną odpowiedź typu sag (grot strzałki) zależną od prądu Ih po wstrzyknięciu prądu hiperpolaryzującego. W ten sposób neurony GABA w SNr i neurony dopaminergiczne w istocie czarnej są jednoznacznie identyfikowane elektrofizjologicznie. B4 przedstawia obraz żelu z produktami scRT-PCR z elektrofizjologicznie zidentyfikowanego neuronu GABA w SNr. Wykryto mRNA dla dehydrogenazy glutaminianowej 1 (GAD1), ale nie wykryto mRNA dla hydroksylazy tyrozynowej (TH). W tym neuronie GABA w SNr wykryto mRNA dla Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 i Kv3.4. B5 przedstawia detekcję scRT-PCR mRNA neuronalnych kanałów Kv3 w neuronie DA w SNr. W elektrofizjologicznie zidentyfikowanym neuronie DA w SNr wykryto mRNA dla TH, ale nie dla GAD1. W tym neuronie DA w SNr wykryto mRNA dla Kv3.2, Kv3.3 i Kv3.4. B6 przedstawia dane zbiorcze.
7. Potencjalne wyniki fałszywie ujemne i fałszywie dodatnie
W oparciu o nasze doświadczenie, kilka czynników może prowadzić do fałszywie ujemnych wyników scRT-PCR. Czynniki te obejmują niepowodzenie w odessaniu wystarczającej ilości cytoplazmy z powodu zapchania końcówki pipety patch, kontaminację RNazą oraz niską wydajność starterów PCR. Zapchanie końcówki pipety patch jest zazwyczaj widoczne na monitorze wideo i objawia się zwiększonym oporem dostępowym. Kontaminacji RNazą można zapobiec poprzez dokładną dezaktywację i noszenie rękawiczek. Skuteczność starterów PCR należy sprawdzić, wykorzystując całkowite RNA z wycinka tkanki mózgu (Zhou et al. 2008; Ding et al. 2011).
Ponieważ przed RT zawsze poddajemy nasze próbki wstępnej obróbce DNazą, nie odnotowaliśmy wyników fałszywie dodatnich. Teoretycznie, bez trawienia DNazą, może dojść do zanieczyszczenia DNA genomicznym i w konsekwencji do fałszywie dodatniego wykrycia w przypadku, gdy gen nie posiada intronów lub gdy para starterów nie obejmuje regionu intronowego.

<ol><li>J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+pacemaker+frequency+of+individual+dopaminergic+neurons+by+Kv4.3L+and+Kchip3.1+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and Kchip3.1 transcription.</a> EMBO J. 20, 5715-5724 (2001).</li>
<li>Surmeier, D. J., Song, W. J., Yan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+expression+of+dopamine+receptors+in+neostriatal+medium+spiny+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Coordinated expression of dopamine receptors in neostriatal medium spiny neurons.</a> J. Neurosci. 16, 6579-6591 (1996).</li>
<li>Zhou, F. W., Matta, S. G., Zhou, F. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutively+active+TRPC3+channels+regulate+basal+ganglia+output+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Constitutively active TRPC3 channels regulate basal ganglia output neurons.</a> J. Neurosci. 28, 473-482 (2008).</li>
<li>Zhou, F. W., Jin, Y., Matta, S. G., Xu, M., Zhou, F. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra-short+dopamine+pathway+regulates+basal+ganglia+output+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An ultra-short dopamine pathway regulates basal ganglia output neurons.</a> J. Neurosci. 29, 10424-10435 (2009).</li>
<li>Ding, S., Matta, S. G., Zhou, F. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kv3-like+potassium+channels+are+required+for+sustained+high-frequency+firing+in+Basal+Ganglia+output+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Kv3-like potassium channels are required for sustained high-frequency firing in Basal Ganglia output neurons.</a> J. Neurophysiol. 105, 554-570 (2011).</li>
<li>Zhou, F. W., Xu, J. J., Zhao, Y., Ledoux, M. S., Zhou, F. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+functions+of+histamine+H1+and+H2+receptors+and+H3+receptors+in+substantia+nigra+pars+reticulata%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Opposite functions of histamine H1 and H2 receptors and H3 receptors in substantia nigra pars reticulata.</a> J. Neurophysiol. 96, 1581-1591 (2006).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Połączenie rejestracji metodą patch clamp w skrawkach mózgu z techniką scRT-PCR, którą tutaj zaprezentowaliśmy, stanowi doskonałą metodę badania profili ekspresji mRNA kanałów jonowych, receptorów oraz kluczowych enzymów syntezy neurotransmiterów w indywidualnie scharakteryzowanych neuronach. Jest to szczególnie użyteczne w sytuacjach, gdy białko nie może zostać wykryte i zlokalizowane za pomocą innych metod, takich jak immunohistochemia, ze względu na niski poziom ekspresji i/lub brak odpowiedniego przeciwciała (Surmeie...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do przetłumaczenia. Czekam na treść z JoVE, aby przygotować profesjonalne tłumaczenie na język polski zgodnie z Twoimi wytycznymi.&quot;&gt;&lt;img src=&quot;/files/ftp_upload/3136/3136tabela1.jpg&quot; tekst alternatywny=&quot;Tabela 1&quot;/&gt; &lt;silny&gt;Tabela 1.&lt;/strong&gt; Kluczowe odczynniki i sprzęt&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Proszę wprowadzić tekst źródłowy do tłumaczenia.&quot;&gt;&lt;img src=&quot;/files/ftp_upload/3136/3136tabela2.jpg&quot; tekst alternatywny=&quot;Tabela 2&quot;/&gt; &lt;silny&gt;Tabela 2.&lt;/strong&gt; Pary starterów dla mRNA kanałów Kv3 neuronów szczura, hydroksylazy tyrozynowej (TH) orazdekarboksylazy kwasu glutaminowego 1 (GAD1) do scRT-PCR&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

profilowanie ekspresji mrna napięciowo zależnych kanałów potasowych w neuronach istoty czarnej z wykorzystaniem technik jedno-komórkowego rt-pcr

Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

W ośrodkowym układzie nerwowym ssaków różne typy neuronów o zróżnicowanej charakterystyce molekularnej i funkcjonalnej są ze sobą wymieszane, co utrudnia ich separację, a także sprawia, że nie są one łatwo identyfikowalne na podstawie morfologii. W związku z tym analiza ekspresji genów w konkretnym typie neuronów jest często trudna. W niniejszym materiale dokumentujemy procedurę łączącą techniki rejestracji patch-clamp w konfiguracji whole-cell z jednokomórkową odczynną polimerazową reakcją łańcuchową z odwrotną transkrypcją (scRT-PCR) w celu profilowania ekspresji mRNA w różnych typach neuronów w istocie czarnej. W pierwszej kolejności wykorzystuje się techniki elektrofizjologiczne do rejestracji właściwości neurofizjologicznych i funkcjonalnych poszczególnych neuronów. Następnie aspiruje się cytoplazm pojedynczych, scharakteryzowanych elektrofizjologicznie neuronów istoty czarnej i poddaje analizie scRT-PCR, aby uzyskać profile ekspresji mRNA dla enzymów syntezy neurotransmiterów, receptorów i kanałów jonowych. Wysoka selektywność i czułość sprawiają, że metoda ta jest szczególnie użyteczna, gdy immunohistochemia nie może zostać zastosowana z powodu braku odpowiedniego przeciwciała lub niskiego poziomu ekspresji białka. Metoda ta ma zastosowanie również do neuronów w innych obszarach mózgu.

W pierwszej kolejności neurony są charakteryzowane elektrofizjologicznie. Następnie z rejestrowanego neuronu aspiruje się cytoplazmę i poddaje ją analizie RT-PCR w celu wykrycia ekspresji mRNA dla enzymów syntezy neuroprzekaźników, kanałów jonowych oraz receptorów.

Profilowanie ekspresji mRNA napięciowo zależnych kanałów potasowych w neuronach istoty czarnej z wykorzystaniem technik jedno-komórkowego RT-PCR

W obrębie ośrodkowego układu nerwowego ssaków różne typy neuronów o zróżnicowanej charakterystyce molekularnej i funkcjonalnej są ze sobą przemieszane, ...

Ogólnym celem tej procedury jest wykrywanie mRNA w poszczególnych neuronach. Osiąga się to poprzez metodę patch-clamp i rejestrację pojedynczych neuronów, a następnie całkowite odessanie cytoplazmy z każdego zarejestrowanego neuronu w celu wyodrębnienia mRNA. Następnie z cytoplazmy przygotowuje się cDNA, które jest powielane metodą PCR.Ostatecznie, specyficzne mRNA dla receptorów, kanałów jonowych i enzymów można wykryć za pomocą konwencjonalnego systemu obrazowania żeli. Nazywam się, pracuję w University of Tennessee Health Science Center. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ ilość mRNA w pojedynczym neuronie jest niezwykle mała i łatwo ją utracić.Protokół należy rozpocząć od użycia wibrotomu do wycięcia koronarnych skrawków mózgu o grubości 300 µm, zawierających środkową część rostralną istoty czarnej. Mózgi można pobrać od szczurów rasy Sprague Dawley w wieku od 15 do 40 dni. Procedurę krojenia skrawków przeprowadza się w temperaturze lodowej w wysokostężonym roztworze sacharozy, natlenionym mieszanką 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla, przy pH 7,4; skrawki należy inkubować w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym napowietrzonym mieszanką gazów 5% dwutlenku węgla i 95% tlenu.Utrzymuj temperaturę 34 °C i pozostaw plastry na 45 minut. Następnie przechowuj plastry mózgu w temperaturze pokojowej do momentu rejestracji. Rozpocznij od przeniesienia jednego plastra mózgu do komory rejestracyjnej patch clamp.W sposób ciągły perfundowano natlenionym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym w temperaturze 32 °C. Pipety do aplikacji (patch pipettes) napełniono autoklawowanym roztworem wewnątrzkomórkowym przygotowanym w wodzie wolnej od DNA i RNA. Napełnioną pipetę wprowadzono do kąpieli.Sprawdź, czy rezystancja wynosi od dwóch do trzech megaomów. Najpierw zlokalizuj istotną czerń (substantia nigra), kierując się jej charakterystycznym położeniem anatomicznym. Następnie, korzystając z optyki Namar i obiektywu 60 x, wybierz duże komórki w obszarach SNC i SNR do rejestracji.Są to bez wątpienia neurony dopaminergiczne lub GABAergiczne. Należy zastosować konwencjonalną konfigurację whole-cell z gigaomowym uszczelnieniem (giga seal), aby przeprowadzić pomiary w trybie clamp prądowy oraz clamp napięciowy. Rejestracje te powinny być zazwyczaj wykonane w czasie krótszym niż pięć minut, aby zminimalizować degradację mRNA.W ciągu około minuty możliwe jest stworzenie elektrofizjologicznych odcisków palca dla wybranych neuronów poprzez rejestrację wyłącznie ich właściwości błonowych oraz charakterystyki potencjałów czynnościowych. Po uzyskaniu danych z wybranego neuronu należy delikatnie odessać cytoplazmę za pomocą ssania ustnego. Szczelna blokada nie powinna zostać przerwana, w przeciwnym razie.Pozakomórkowe zanieczyszczenia, w tym mRNA, mogą zostać zaciągnięte do pipety patchowej i zanieczyścić zawartość komórki. Wypchnij zawartość komórki do probówki PCR o pojemności 0,2 mililitra, łamiąc końcówkę pipety i przykładając lekkie ciśnienie dodatnie. Po zakończeniu natychmiast umieść probówkę w zamrażarce o temperaturze -20°C, aby wykluczyć kontaminację pozakomórkowymi zanieczyszczeniami, które mogą zawierać mRNA.Przygotuj kontrolę negatywną, zbierając zawartość pipety patch opuszczonej do tkanki bez wykonywania aspiracji. Po zebraniu zawartości komórkowej z 10 do 20 neuronów niezwłocznie rozpocznij reakcję odwrotnej transkrypcji. Aby zminimalizować degradację mRNA, zacznij od trawienia ewentualnego zanieczyszczonego DNA genomowego za pomocą DNazy przez pięć minut w temperaturze 25 °C.Ten etap jest krytyczny w celu zminimalizowania ryzyka wyników fałszywie dodatnich i nie należy go pomijać. Następnie należy inaktywować DNA, dodając 1,2 µL 25 mM EDTA, a próbki inkubować w temperaturze 70 °C przez pięć minut. Teraz, przy użyciu dostępnego komercyjnie zestawu, należy zsyntetyzować CD NA, aby zweryfikować, czy DNA genomowe zostało całkowicie usunięte.Przeprowadź reakcję kontrolną dla każdej próbki bez odwrotnej transkryptazy, zachowując wszystkie pozostałe składniki reakcji bez zmian. Produkty przechowuj w temperaturze -20 °C do czasu ich wykorzystania w procedurze PCR.Startery zgodnie z sekwencjami w Gen bank, o ile to możliwe, należy zaprojektować tak, aby obejmowały miejsce połączenia intronu z eksonem, co ułatwi wykrycie kontaminacji DNA genomicznego. Aby sprawdzić skuteczność par starterów, należy w pierwszym etapie przetestować je na cDNA z całego mózgu. 5 µL z 30 µL cDNA poddać amplifikacji PCR przez 35 cykli, stosując standardowy protokół cykli termicznych.W drugim etapie należy przeprowadzić amplifikację PCR 1 µL produktu PCR z pierwszego etapu, używając tych samych starterów oraz lekko zmodyfikowanego profilu cykli. Następnie produkty należy rozdzielić na żelu AGROS 2,5% i zwizualizować z użyciem bromku etydium lub GelGreen. Pod wpływem światła UV należy wyciąć pasma dodatniego DNA, a następnie przeprowadzić sekwencjonowanie z wykorzystaniem dostępnego komercyjnie zestawu do izolacji DNA.Porównano charakterystyki elektrofizjologiczne neuronów w istocie czarnej, części zwartej oraz części siateczkowatej. Neurony GABAergiczne SNR wykazywały częstotliwość wyższych, spontanicznych wyładowań o częstotliwości około 10 hertz. Wyładowania te miały podstawową czas trwania około jednej milisekundy po wstrzyknięciu prądu hiperpolaryzującego.Neurony GABAergiczne SNR wykazały subtelną odpowiedź SAG, co wskazuje na słabo aktywowany prąd. W przeciwieństwie do nich, nigralne neurony dopaminergiczne wykazywały niskoczęstotliwościowe spontaniczne kolce o czasie trwania bazy około trzech milisekund. Neurony dopaminergiczne wykazały również wyraźny SAG w odpowiedzi na hiperpolaryzację, co wskazuje na silną ekspresję prądu IH w neuronach GABAergicznych SNR, ale nie w neuronach dopaminergicznych.Metoda Single cell R-T-P-C-R wykryła mRNA dladekarboksylazy kwasu glutaminowego 1, kluczowego enzymu w syntezie GABA. W przeciwieństwie do tego, zidentyfikowano neurony dopaminergiczne w SNC i SNR, ale nie w neuronach GABAergicznych. Metoda Single cell R-T-P-C-R wykryła mRNA dla hydroksylazy tyrozynowej, kluczowego enzymu w syntezie dopaminy.Następnie zastosowano metodę jednokomórkowej RT-PCR w celu profilowania ekspresji podjednostek kanałów KV3 aktywowanych napięciem, które modyfikują właściwości napięciowo zależnych kanałów potasowych. W przykładzie SNR gaba, mRNA dla KV 3.1, 3.2, 3.3 i 3.4 wykryto wyłącznie w przykładowym neuronie S-N-R-D-A. KV 3.2, 3.3 i 3.4 wykryto w danych zbiorczych.Kanał KV 3.1 wykryto częściej w neuronach GABAergicznych SNR niż w neuronach dopaminergicznych prążkowia, co wskazuje na wyższy poziom ekspresji KV 3.1 w szybkich neuronach GABA SNR. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie o założeniu rękawiczek i utrzymaniu narzędzi w czystości po zakończeniu prac. Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny neuronauki do zgłębiania ekspresji i funkcji receptorów oraz kanałów jonowych w układzie nerwowym.

profiling-voltage-gated-potassium-channel-mrna-expression-nigral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Analiza ekspresji kanału potasowego sterowanego napięciem mRNA w neuronach nigralnych przy użyciu technik jednokomórkowej RT-PCR

Zaprezentujemy konfigurację i analizę tablic 96-dołkowych pre-microRNA do QPCR, przeprowadzonych zarówno przy użyciu robota, jak i ręcznie za pomocą wielokanałowej pipety Thermo Scientific Matrix.

Profilowanie pre-microRNA i microRNA z wykorzystaniem matryc ilościowej PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

Profilowanie ekspresji pojedynczych komórek umożliwia szczegółową analizę ekspresji genów w poszczególnych komórkach. Opisujemy metody izolacji kardiomiocytów oraz przygotowania otrzymanych lizatów do analizy całego transkryptomu za pomocą mikromacierzy lub qPCR specyficznych celów.

Profilowanie transkrypcyjne pojedynczych komórek kardiomiocytów dorosłej myszy

Opisano metodę izolacji pojedynczych komórek siatkówki oraz następującej po niej amplifikacji ich cDNA. Transkryptomika pojedynczych komórek pozwala określić stopień heterogeniczności komórkowej występującej w tkance oraz odkryć nowe geny markerowe dla rzadkich populacji komórek. Dołączony protokół można dostosować do wielu różnych typów komórek.

Profilowanie pojedynczych komórek rozwijających się i dojrzałych neuronów siatkówki

Ślimak morski Aplysia californica był powszechnie używany jako model neurobiologiczny do badań nad komórkowymi i molekularnymi podstawami zachowania. Opisano metodologię badania układu nerwowego Aplysia do analiz elektrofizjologicznych i molekularnych pojedynczych neuronów zidentyfikowanych obwodów neuronalnych.

Aplizja Przygotowanie zwojów nerwowych do analiz elektrofizjologicznych i molekularnych pojedynczych neuronów

Opisujemy protokół PCR w czasie rzeczywistym do profilowania mikroRNA w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF). Z wyjątkiem protokołów ekstrakcji RNA, procedura może zostać rozszerzona na RNA wyekstrahowane z innych płynów ustrojowych, hodowanych komórek lub próbek tkanek.

Profilowanie mikroRNA płynu mózgowo-rdzeniowego za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

Test ekspresji genów jednokomórkowych jest potrzebny do zrozumienia heterogeniczności komórek macierzystych.

Profilowanie pojedynczych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą ilościowego RT-PCR

Opisujemy metodę sortowania pojedynczych komórek ssaków i ilościowego określania ekspresji do 96 docelowych genów w każdej komórce. Metoda ta obejmuje wykorzystanie wewnętrznych wzorców qPCR w celu umożliwienia oszacowania bezwzględnej liczby transkryptów.

Profilowanie ekspresji genów w pojedynczej komórce za pomocą FACS i qPCR z wewnętrznymi standardami

Ten protokół opisuje kluczowe kroki i środki ostrożności wymagane do przeprowadzenia reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w pojedynczej komórce po patch-clamp. Technika ta jest prostą i skuteczną metodą analizy profilu ekspresji z góry określonego zestawu genów z pojedynczej komórki, charakteryzującego się zapisami patch-clamp.

Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją w monokomórkach po patch-clamp

Ten protokół wyjaśnia, jak zbierać pojedyncze neurony, mikroglej i astrocyty z centralnego jądra ciała migdałowatego z dużą dokładnością i anatomiczną specyficznością za pomocą mikrodysekcji laserowej. Dodatkowo wyjaśniamy nasze zastosowanie mikroprzepływowego RT-qPCR do pomiaru podzbioru transkryptomu tych komórek.

Połączenie mikrodysekcji wychwytu laserowego i mikroprzepływowego qPCR w celu analizy profili transkrypcyjnych pojedynczych komórek: podejście biologii systemowej do uzależnienia od opioidów

Różne regiony móżdżku są zaangażowane w różne procesy behawioralne, jednak leżące u ich podstaw mechanizmy molekularne pozostają nieznane. W pracy opisano metodę powtarzalnego i szybkiego preparowania kory móżdżku półkul, przednich i tylnych obszarów robaka oraz głębokich jąder móżdżku w celu zbadania różnic molekularnych poprzez wyizolowanie RNA i zbadanie różnic w ekspresji genów.

Rozwarstwienie regionalne móżdżku do analizy molekularnej

Badanie to przedstawia solidną metodę izolacji mRNA aksonalnych za pomocą wkładek z błony porowatej, umożliwiając całkowite rozdzielenie neuronów od neurytów oraz oczyszczanie RNA. W połączeniu z RTddPCR podejście pozwala na absolutną ilościową ilościową ilościową transkrypcję o niskiej liczbie kopii, ułatwiając badania transportu mRNA i lokalnej translacji o wysokiej czułości, powtarzalności i szerokim zastosowaniu eksperymentalnym.

Izolacja i ilościowa ilościowość mRNA aksonalnych z użyciem wkładek z błony porowatej oraz RTddPCR

Poznaj metodę detekcji mRNA w pojedynczych neuronach przy użyciu patch clampingu i RT-PCR. Technika ta umożliwia analizę ekspresji genów dla kanałów jonowych i receptorów w badaniach neurofizjologicznych.

Profilowanie ekspresji mRNA kanału potasowego bramkowanego napięciem w neuronach nigralnych przy użyciu technik RT-PCR dla pojedynczych komórek (Wideo) | JoVE Journal

Profilowanie ekspresji mRNA napięciowo zależnych kanałów potasowych w neuronach istoty czarnej z wykorzystaniem technik jedno-komórkowego RT-PCR

Przeglądaj więcej filmów