Profilowanie ekspresji mRNA kanału potasowego bramkowanego napięciem w neuronach nigralnych przy użyciu technik RT-PCR dla pojedynczych komórek

Ogólnym celem tej procedury jest wykrycie informacyjnego RNA w poszczególnych neuronach. Osiąga się to poprzez zaciskanie łat i rejestrowanie pojedynczych neuronów, a następnie całkowite zasysanie cytoplazmy z każdego zarejestrowanego neuronu z Mr.mRNA i cytoplazmy. CD NA jest wytwarzany i amplifikowany metodą PCR.

Ostatecznie specyficzne mRNA dla receptorów, kanałów jonowych i enzymów można wykryć za pomocą konwencjonalnego systemu obrazowania żelowego. Nazywam się i pracuję w Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Tennessee. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ liczba rezonansów magnetycznych w jednym neuro jest niezwykle mała i łatwo ją stracić.

Rozpocznij ten protokół od użycia wibratora do wycięcia koronalnych wycinków mózgu o grubości 300 mikrometrów, zawierających środkową część rostralną pokaźnej nigry. Mózgi można wyizolować od 15 do 40 dniowych szczurów rasy spra dolly. Procedura krojenia plastrów jest wykonywana na zimno w roztworze do cięcia o wysokiej zawartości sacharozy, natleniana 95% tlenem i 5% dwutlenkiem węgla, a przy pH 7,4 inkubuje plastry w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym i bąbelkuje 5% dwutlenkiem węgla i 95% tlenem gazowym.

Utrzymuj temperaturę 34 stopni Celsjusza i pozostaw tam plastry na 45 minut. Następnie utrzymuj plastry mózgu w temperaturze pokojowej do momentu nagrania. Zacznij od przeniesienia jednego wycinka mózgu do komory zapisowej z zaciskiem krosowym.

Stale perfuzjowany natlenionym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym w temperaturze 32 stopni Celsjusza. Napełnij pipety z plastrami autoklawowym roztworem wewnątrzkomórkowym przygotowanym z wodą wolną od DNA i RNA. Opuść załadowaną pipetę do wanny.

Sprawdź, czy rezystancja wynosi od dwóch do trzech megaomów. Po pierwsze, zlokalizuj pokaźną czarnówkę według jej wyraźnego i anatomicznego położenia. Następnie, używając optyki Namar i obiektywu 60x, wybierz duże komórki w SNC i SNR do nagrywania.

Są to możliwe neurony dopaminergiczne lub GABA-ergiczne bez wahania. Użyj konwencjonalnej konfiguracji całego ogniwa z giga szczelnym uszczelnieniem, aby uzyskać cęgi prądowe i zaciski napięciowe. Zapisy te zazwyczaj powinny być wykonywane w czasie krótszym niż pięć minut, aby zminimalizować degradację mRNA.

W ciągu około minuty możliwe jest dostarczenie elektrofizjologicznych odcisków palców dla interesujących neuronów, rejestrując tylko ich właściwości błonowe i impulsowe. Po uzyskaniu danych z interesującego neuronu, użyj delikatnego ssania ust, aby odessać cytoplazmę. Szczelne uszczelnienie nie powinno zostać zerwane, ponieważ jest inaczej.

Zanieczyszczenia zewnątrzkomórkowe, w tym mRNA, mogą zostać zassane do pipety z plastrem i zanieczyścić zawartość komórki. Wyrzuć zawartość komórek do 0,2 mililitrowej probówki do PCR, łamiąc końcówkę pipety i stosując lekkie nadciśnienie. Po zakończeniu natychmiast umieść probówkę w zamrażarce o temperaturze ujemnej 20, aby wykluczyć zanieczyszczenie resztkami zewnątrzkomórkowymi, które mogą zawierać mRNA.

Przeprowadzić kontrolę ujemną, zbierając zawartość pipety z plastrem zanurzoną w tkance bez użycia aspiracji. Po zebraniu zawartości komórek od 10 do 20 neuronów natychmiast rozpocznij reakcję odwrotnej transkrypcji. Aby zminimalizować degradację mRNA, zacznij od trawienia wszelkich zanieczyszczeń genomowego DNA za pomocą DNA, jeden przez pięć minut, w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Ten krok ma kluczowe znaczenie dla zmniejszenia potencjalnych wyników fałszywie dodatnich i nie należy go omijać. Następnie dezaktywuj DNA, jeden za pomocą 1,2 mikrolitra 25-milimolowego EDTA i inkubuj próbki w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez pięć minut. Teraz użyj dostępnego na rynku zestawu do syntezy CD NA, aby sprawdzić, czy genomowe DNA zostało całkowicie usunięte.

Przeprowadzić reakcję kontrolną każdej próbki bez odwrotnej transkryptazy. Podczas gdy wszystkie inne składniki reakcji pozostają takie same. Przechowuj produkty w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż będą potrzebne do projektu PCR.

Startery zgodnie z sekwencjami w banku Gen, gdy tylko jest to możliwe, tworzą T intro obejmujące naprawy główne, aby pomóc w wykryciu zanieczyszczenia genomowego DNA. Aby sprawdzić skuteczność par starterów, przetestuj je na całym CD NA mózgu w pierwszym etapie. PCR wzmacnia pięć mikrolitrów z 30 mikrolitrowych CDNA przez 35 cykli przy użyciu standardowego protokołu cykli termicznych.

W drugim etapie PCR amplifikuje jeden mikrolitr produktu PCR pierwszego etapu z tą samą podstawową naprawą i stosuje nieznacznie zmodyfikowany profil cykliczny. Teraz oddziel produkty na żelu 2,5% AGROS i zwizualizuj je za pomocą bromku AUM lub zielonego żelu. W świetle UV wytnij dodatnie prążki DNA i zsekwencjonuj je za pomocą dostępnego w handlu zestawu do pobrania DNA.

Porównano charakterystyki elektrofizjologiczne neuronów w substancjalnych nigrach, pars, compacta i pars reticulata. Neurony SNR GABA-ergiczne wykazywały wyższą częstotliwość, spontanicznie wzrastając przy około 10 hercach. Skoki miały podstawowy czas trwania około jednej milisekundy po wstrzyknięciu prądu hiperpolaryzującego.

SNR Neurony GABA-ergiczne wykazywały subtelną odpowiedź SAG, wskazującą na tygodniowy aktywowany prąd. W przeciwieństwie do tego, neurony dopaminergiczne nigro wykazywały spontaniczne skoki o niskiej częstotliwości, których podstawowy czas trwania wynosił około trzech milisekund. Neurony dopaminergiczne wykazywały również wyraźny SAG w odpowiedzi na hiperpolaryzację, co wskazuje na silną ekspresję prądu IH w neuronach SNR GABAergicznych, ale nie w neuronach dopaminergicznych.

Jednokomórkowy R-T-P-C-R wykrył mRNA dla dekarboksylazy kwasu glutaminowego, kluczowego enzymu w syntezie GABA. W przeciwieństwie do tego, zidentyfikowano neurony dopaminergiczne SNC i SNR, ale nie w neuronach GABA-ergicznych. Jednokomórkowy R-T-P-C-R wykrył mRNA hydroksylazy tyrozyny, kluczowego enzymu do syntezy dopaminy.

Następnie wykorzystano pojedynczą komórkę R-T-P-C-R do profilowania ekspresji aktywowanych napięciem podjednostek trójkanałowych KV, które zmieniają właściwości kanałów potasowych bramkowanych napięciem. W przykładowym SNR gaba mRNA neuronów dla KV 3.1, 3.2, 3.3 i 3.4 wykryto tylko w przykładowym neuronie S-N-R-D-A. KV 3.2, 3.3 i 3.4 zostały wykryte w połączonych danych.

KV 3.1 był częściej wykrywany w neuronach SNR GABAergic niż w neuronach dopaminergicznych nigro, co wskazuje na wyższy poziom ekspresji KV 3.1 w szybkich neuronach SNR GABA Wikingów. Próbując tej procedury, należy pamiętać o założeniu rękawiczek i pozostawieniu narzędzi wolnych od nauki po ich opracowaniu. Technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie neurobiologii do zbadania ekspresji i funkcji receptorów oraz kanałów jonowych w układzie nerwowym.